Author(s): Porfírio, Ana Raquel Chaves Mendes de Alves
Date: 2016
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.1/8263
Origin: Sapientia - Universidade do Algarve
Subject(s): Listeria monocytogenes; Modelo animal; Streptococcus pneumoniae; Pneumolisina; Fatores de virulência; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Outras Engenharias e Tecnologias
Dissertação de Mestrado, Engenharia Biológica, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2016
Listeria monocytogenes é o agente etiológico da listeriose, uma doença que afeta predominantemente indivíduos imunocomprometidos, fetos, recém-nascidos e idosos. Pode igualmente afetar animais como ovelhas e cabras. A infeção está associada ao consumo de alimentos contaminados, alimentos pré-cozinhados, vegetais, carnes e produtos lácteos. A contaminação destes produtos pode ocorrer no ambiente de processamento. Esta bactéria consegue crescer a temperaturas muito baixas como 4ºC (psicrotrófica) e é capaz de tolerar temperaturas mais elevadas como 45ºC. Em relação ao valor de pH pode crescer entre os valores de 4.5 a 9.6. O largo espectro de temperaturas e valores de pH dificultam o controlo bacteriano nas indústrias visto que, é dentro destes valores que muitas das operações são efetuadas. A listeriose pode ocorrer em dois níveis distintos de doença, ao nível não invasivo que pode afetas adultos saudáveis onde os sintomas incluem vómitos e diarreia, enquanto o nível invasivo da doença, a sua forma mais agressiva pode manifestar-se sob a forma de meningite, septicemia e provocar o aborto em mulheres grávidas. L. monocytogenes é uma bactéria intracelular que possui vários fatores de virulência, entre eles duas internalinas – InlA e InlB -, que são utilizadas pela bactéria para que esta consiga atravessar a barreira intestinal, a barreira hematoencefálica e a barreira placentária. Com a ajuda destas internalinas a bactéria consegue entrar dentro da célula hospedeira onde posteriormente irá causar a morta da mesma. Para conhecer melhor os fatores que afetam este mecanismo e para entender melhor o papel e importância de certos genes associados à resistência desta bactéria a inúmeros fatores como, por exemplo, a sua resistência a metais, um modelo animal para estudos in vivo é necessário. Para a construção de um modelo animal eficaz foram, efetuadas mutações no fator de virulência InlA para que a bactéria se conseguisse ligar ao recetor das células epiteliais do ratinho, uma vez que existe uma forte especificidade em relação à espécies hospedeira, o que faz com que o tipo selvagem apenas se consiga ligar ao recetor das células epiteliais humana. Dado que a via natural de infeção ocorre através da ingestão de alimentos contaminados, a técnica de infeção preferencial para modelos in vivo que melhor se assemelha à infeção natural é a oral gavage. O presente estudo teve como objetivo a elaboração de um modelo de base de infeção de ratinhos por oral gavage, onde se desejava alcançar 100% de mortalidade com a menor dose bacteriana possível. Os resultados mostraram que uma suspensão bacteriana com 5x109CFU/500μl é suficiente para provocar 100% de mortalidade num período médio de 60 horas. No presente estudo foi ainda possível a construção de mutantes da bactéria Streptococcus pneumoniae. A bactéria S. pneumoniae causa doenças invasivas, como a pneumonia, meningite e septicemia, e doenças não invasivas, como é o caso de otite média. Apesar de causar estes tipos de doenças, esta bactéria é um agente bacteriano comensal da nasofaringe não causando qualquer doença. Contudo de acordo com o estudo efetuado pela World Health Organization (WHO) em 2000, cerca de 826 000 crianças com menos de 5 anos de idade morreram de doença pneumocócica, sendo que 61% destas mortes ocorreram predominantemente em países Africanos e Asiáticos. As infeções pneumocócicas são transmitidas de pessoa para pessoa através de aerossóis. A primeira fase da infeção é a colonização da nasofaringe onde não há nenhum sintoma associado, podendo depois ocorrer dois cenários: a bactéria permanece sem causar qualquer doença ou alastra-se para outros órgãos, como os ouvidos ou os pulmões. Se a bactéria atingir os pulmões poderá causar pneumonia e, caso consiga atravessar a barreira mucosa, poderá ultrapassar a barreira hematoencefálica provocando a meningite. S. pneumoniae tem inúmeros fatores de virulência, entre os quais enzimas, proteínas de superfície, a cápsula polissacárida e a toxina pneumolisina (Ply). Um dos fatores mais importantes para a virulência da bactéria é a toxina pneumolisina que, apesar de ser dos fatores mais estudados o seu papel ainda não está totalmente classificado. O segundo objetivo deste estudo foi a criação de mutações em duas bactérias fluorescentes, S. pneumoniae D39 GFP+ e S. pneumoniae D39 RFP+ (do inglês “Green flourescent protein” e “Red flourescent protein”), onde o gene da pneumolisina (ply) foi substituído pelo gene de resistência à espectinomicina. A inserção destas mutações não afetou a fluorescência da bactéria, e como tal, o trabalho futuro será a visualização in vivo do comportamento de S. pneumoniae na presença e na ausência da toxina pneumolisina o que irá permitir compreender melhor a influência quer da toxina pneumolisina quer dos outros fatores de virulência no potencial de virulência de S. pneumoniae D39.
