Author(s): Carrola, Joana Carolina Quintela
Date: 2009
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.6/1342
Origin: uBibliorum
Subject(s): Proteínas G; Rodopsina; Proteínas G - Receptores acoplados; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química
The follicle-stimulating hormone (FSH) is involved in the regulation of reproduction, by acting through a G protein-coupled receptor (GPCR) on the surface of target cells. Like most of the GPCRs, not much is known about the structure of the follicle-stimulating hormone receptor (FSHR). It is relatively difficult to purify the FSHR protein from gonadal tissues, due to its low abundance on its native cells, and therefore, to study its structure. For these reasons it is necessary to come up with a strategy that allows the production of large quantities of protein in order to use it in studies to obtain detailed structural information on full-length human FSHR. Via polymerase chain reactions, site-directed mutagenesis and other molecular biological methods, we were able to construct mutated receptors with different signal sequences and different tags, including the last fifteen amino acids of human rhodopsin which allow the receptor to be expressed on retinal rod cells of zebrafish. Mutations were designed in a manner that the receptor becomes inactive, i.e. incapable of signal transduction but still expressed at cell surface. The receptor constructs were first tested in human embryonic kidney cells (HEK 293-T) and their inserts will be used for transgenetic studies on zebrafish in the future.
A hormona estimulante do folículo (FSH) está envolvida na regulação da reprodução, actuando através de um receptor acoplado a proteínas G (GPCR) localizado à superfície das células alvo. Tal como a maioria dos GPCRs, pouco se sabe acerca da estrutura do receptor da hormona estimulante do folículo (FSHR). Este receptor é relativamente difícil de purificar de tecidos gonadais, devido à pouca abundância com que se encontra nas suas células nativas, e, portanto, de estudar a sua estrutura. Por estas razões é necessário criar uma estratégia que permita a produção de grandes quantidades de proteína de modo a poder usá-la em estudos dirigidos à obtenção de informação detalhada da estrutura completa do FSHR. Através de reacções em cadeia da polimerase, mutagénese dirigida e outros métodos biomoleculares foi possível construir receptores mutantes com diferentes sequências sinal e diferentes tags, incluindo os últimos quinze aminoácidos da rodopsina humana que permitem a expressão do receptor em bastonetes da retina de peixe zebra. As mutações foram criadas de modo a que o receptor se torne inactivo, i.e. incapaz de realizar transdução de sinal mas que ainda é expresso à superfície da célula. Os receptores foram primeiro testados em células embriónicas humanas do rim (HEK 293-T) e os insertos serão usados em estudos de transgénese em peixe zebra.
