Author(s): Mariana, Melissa Rodrigues
Date: 2013
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.6/3260
Origin: uBibliorum
Subject(s): Contractilidade muscular; Canais de cálcio tipo L; Patch clamp; PCSA - Técnica de laboratório
Author(s): Mariana, Melissa Rodrigues
Date: 2013
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.6/3260
Origin: uBibliorum
Subject(s): Contractilidade muscular; Canais de cálcio tipo L; Patch clamp; PCSA - Técnica de laboratório
As células do músculo liso (SMC) vascular são fundamentais para a regulação do tónus vascular e têm capacidade de responder a diversos estímulos hormonais e hemodinâmicos. São células altamente especializadas que podem contribuir para o estudo de vários processos de sinalização envolvidos no controlo do tónus vascular, tais como o metabolismo do cálcio e diferentes vias envolvidas na modulação da reatividade vascular. A regulação do fluxo de Ca2+ é fundamental para a contração e a sua desregulação pode estar envolvida na patofisiologia de diversas doenças cardiovasculares. A entrada de cálcio nas células do músculo liso vascular através de canais de Ca2+ tipo L (LTCC) pode ser desencadeada pela ativação de recetores presentes na membrana plasmática ou por despolarização da membrana. A formação do complexo Ca2+-calmodulina leva à ativação da cadeia leve de miosina (MLC), e é o estado de fosforilação desta que determina a atividade contráctil do músculo liso. Os compostos macrocíclicos são macromoléculas cíclicas que podem ser usadas como transportadores moleculares, uma vez que, para além de terem a capacidade de atravessar a membrana celular sem alterar a sua integridade, não são tóxicos nas concentrações usadas e podem transportar outras moléculas. Os macrocíclos são considerados como importantes hospedeiros seletivos em algumas aplicações biológicas, nomeadamente em solubilizadores e estabilizadores de fármacos e agentes anticancerígenos, formando complexos estáveis e específicos. O principal objetivo deste trabalho é analisar se os macrocíclos têm atividade biológica. Assim, foi estudado o efeito de diferentes compostos macrocíclicos (MaC) sobre a atividade dos canais de Ca2+ tipo L e sobre a contractilidade das células A7r5. Utilizou-se a técnica Patch Clamp na configuração whole cell para medir a atividade dos LTCC nas células A7r5. O efeito de quatro macrocíclos (Me2[28]py2N6, [16]phenN2, [32]phen2N4, [30]phen2N6) foi analisado a diferentes concentrações (0,01μM, 0,1μM, 1μM e 10μM) sobre a corrente basal de Ca2+ e estimulada por Bay K (Bay K8644 – ativador específico dos LTCC). Foi também analisado o efeito destes MaC, nas mesmas concentrações, sobre a contractilidade das SMC vasculares através da técnica de PCSA (Planar Cell Surface Area), usando um microscópio de fluorescência. Este efeito foi analisado após contração das células com serotonina e noradrenalina. Pelos resultados obtidos através do Patch clamp e do PCSA pode-se observar que, nas concentrações mais baixas, o [32]phen2N4 inibe ligeiramente os LTCC, tanto a corrente basal como a corrente estimulada por Bay K. Relativamente à contractilidade, este composto não tem qualquer efeito sobre a contração induzida por serotonina ou por noradrenalina. No que diz respeito ao [16]phenN2 e ao [30]phen2N6, verifica-se que estes MaC não ativam nem inibem os LTCC mas, por outro lado, induzem redução da área celular. No caso do Me2[28]py2N6, este ativa os LTCC, de forma não significativa, mas este efeito parece não estar concordante com o efeito a nível da contractilidade, pois este MaC não tem efeito significativo sobre a redução da área celular. Assim, dos macrocíclos estudados, o [32]phen2N4 na concentração mais baixa (0,01μM) pode ser considerado como um bom transportador de fármacos, uma vez que não apresenta um efeito prejudicial sobre o sistema cardiovascular.
The vascular smooth muscle cells (SMC) are crucial for the vascular tone regulation and have the ability to respond to various hormonal and hemodynamic stimuli. These are highly specialized cells that can contribute to the study of several signaling processes involved in the control of vascular tone, such as calcium metabolism and different pathways involved in the modulation of vascular reactivity. The regulation of Ca2+ flux is pivotal and important for contraction and its deregulation can be involved in the pathophysiology of some cardiovascular diseases. The entry of calcium into vascular smooth muscle cells through Ltype calcium channels (LTCC) can be triggered by the activation of receptors present on plasma membrane or by membrane depolarization. The Ca2+ -calmodulin complex formation leads to the activation of the myosin light chain (MLC), and it is its phosphorylation state that determines the contractile activity in smooth muscle. The macrocyclic compounds are cyclic macromolecules that can be used as molecular carriers, because besides having the ability to cross the cell membrane without altering its integrity, they are nontoxic in the concentrations used. Macrocyclic ligands are considered as important selective hosts in some biological applications, in particular drug solubilizers and stabilizers and anticancer agents, forming stable and specific complexes. The aim of this work is to analyze whether the macrocycles have biological activity. Therefor, it was studied the effect of different macrocyclic compounds (MaC) on the activity of the L-type calcium channels and contractility in A7r5 cells. These studies are the first step before trying to use the MaC as carriers for phosphodiesterases inhibitors. The whole cell configuration of Patch Clamp technique was used to measure the LTCC activity in A7r5 cells. The effect of four MaC (Me2[28]py2N6, [16]phenN2, [32]phen2N4, [30]phen2N6) was analyzed at different concentrations (0,01µM, 0,1µM, 1µM and 10µM) on basal and stimulated (Bay K8644 - a specific stimulator of the LTCC) activity of LTCC. It was also analyzed the effect of the related MaC in the same concentrations (0,01µM, 0,1µM, 1µM and 10µM) on vascular SMC contractility by PCSA (Planar Cell Surface Area) technique, using a fluorescence microscope. This effect was analysed after contracting the cells with serotonin and norepinephrine. From the results obtained by Patch Clamp and PCSA techniques, it is observed that at the lowest concentrations the [32]phen2N4 slightly inhibits LTCC, both basal and Bay K8644 stimulated activity. Regarding contractility, this compound has no effect on the contraction induced by serotonin or noradrenaline. It appears that [16]phenN2 and [30]phen2N6 do not activate or inhibit LTCC but, on the other hand, these MaC induce reduction in cell area. In the case of Me2[28]py2N6, this activates the LTCC but this effect does not seem consistent in terms of contractility, since this MaC does not have no significant effect on reducing cell area. Thus, from the macrocycles studied, [32]phen2N4 at the lowest concentration (0,01μM) can be considered as a good drug carrier, since it does not display a damaging effect on the cardiovascular system.