Author(s): Nunes, Vanessa Sofia Lopes
Date: 2009
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.6/3861
Origin: uBibliorum
Subject(s): Catecol-O-metiltransferase (COMT); Cromatografia de interacção hidrofóbica; Enzima - COMT; COMT - Estrutura; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química
A enzima catecol-O-metiltransferase (COMT), tem vindo a despertar grande interesse na comunidade científica desde a sua descoberta em finais dos anos 50. Devido à função biológica que desempenha, esta enzima tem sido associada a diversas doenças humanas, tal como a Doença de Parkinson (DP), a esquizofrenia ou o cancro associado a estrogénios. De facto, são actualmente administrados inibidores da COMT como adjuvantes na terapia da DP. Assim, torna-se necessário o planeamento e desenvolvimento de processos de purificação de COMT solúvel humana (hSCOMT), que permitam obter enzima activa e pura em quantidade suficiente para utilização em posteriores estudos farmacológicos e estruturais. A Cromatografia de Interacção Hidrofóbica (HIC) surgiu recentemente como uma técnica bastante eficiente no isolamento de hSCOMT. No entanto, as concentrações moderadamente elevadas de Sulfato de Amónio (SA), geralmente usadas na promoção de interacções hidrofóbicas, podem levar à desnaturação de proteínas mais sensíveis. Uma alternativa bastante viável para evitar este fenómeno poderá ser o Citrato de Sódio (CS), já que o citrato é um ião anti-caotrópico e biodegradável e está descrito como um poderoso estabilizador proteico. Assim, a HIC foi utilizada no passo chave do processo de purificação de hSCOMT, onde vários sistemas de dois sais constituídos por SA e CS, aliados a baixa temperatura (5°C), foram aplicados e testados em dois adsorbentes hidrofóbicos típicos, octil- e butil-Sepharose. O suporte octil possui uma cadeia n-alquil maior, de 8 átomos de carbono, apresentando uma maior hidrofobicidade, e, portanto, requer menores concentrações de sal (25 mM SA e CS) na ligação completa de hSCOMT que a resina butil (300 mM SA e 200 mM CS). Em ambos os adsorbentes, a eluição total da enzima foi conseguida com a diminuição da força iónica até 0 mM de sal. A estratégia desenvolvida no suporte butil leva a uma quebra significativa na actividade de hSCOMT, devido ao uso de concentrações mais elevadas de sal no passo de adsorpção, apesar de ser alcançado um grau de pureza aceitável. Por outro lado, a estratégia do suporte octil permite a ligação e eluição completa de hSCOMT com baixas concentrações de sal, atingindo-se um excelente grau de pureza e uma degradação basal da enzima que se traduz em elevados níveis de actividade específica de hSCOMT. De facto, os níveis de SA foram reduzidos em 96% relativamente a estratégias de HIC já descritas na literatura com recurso a gradientes por passos de SA apenas. De igual forma, a manipulação da temperatura no passo de eluição na estratégia descrita representou uma vantagem adicional para uma maior recuperação de hSCOMT sem agregação nos rendimentos obtidos. Assim, a inclusão de concentrações basais de CS e baixa temperatura em estratégias de HIC permitiu a redução da degradação de hSCOMT, resultando em elevados níveis de actividade, assim como a obtenção de enzima com um grau de pureza excelente, apenas obtido após dois passos cromatográficos realizados em estudos anteriores.
The enzyme catechol-O-methyltransferase (COMT) has been arousing a great interest in the scientific community since its discovery in the late 1950s. Due to the biological function played by COMT, it has been associated to several human disorders, like Parkinson’s Disease (PD), schizophrenia and estrogen-induced cancers. Indeed, COMT inhibitors are currently administered as adjuvants in PD symptomatic therapy. Thus, it becomes necessary to plan and develop purification processes for human soluble COMT (hSCOMT), so we can obtain active and highly pure enzyme in enough amounts for pharmacological and structural studies. Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC) has been recently emerging as an efficient technique for hSCOMT isolation. However, moderately high SA concentrations, used to promote hydrophobic interactions, may lead to denaturation of more sensible proteins. A good alternative to avoid this phenomenon can be sodium citrate (CS), since citrate is a biodegradable and anti-chaotropic ion, described as a powerful protein stabilizer. Therefore, HIC was applied in the key step of a hSCOMT purification process, where several dual salt systems containing SA and CS, allied to low temperature (5°C), were loaded and tested into two typical hydrophobic adsorbents, octyl- and butyl-sepharose. The octyl support is composed of a larger ligand n-alkil chain, thus presenting higher hydrophobicity, and so it requires lower salt concentrations (25 mM SA and CS) to achieve complete hSCOMT binding than butyl resin (300 mM SA and 200 mM CS). In both adsorbents total elution was obtained with decreasing ionic strength until 0 M salt. The dual salt strategy developed in butyl support led to a significant break in hSCOMT activity, due to higher salt concentrations used in the adsorption step, in spite of being achieved an acceptable purity degree. Furthermore, octyl strategy allowed total hSCOMT binding and elution at low salt concentrations, reaching an excellent purity degree and less enzyme aggregation and denaturation which corresponded to high hSCOMT specific activity levels. Indeed, SA levels were reduced in 96%, relatively to HIC strategies described in literature using a stepwise gradient of SA. Also manipulation of temperature in the elution step represented an additional advantage to higher levels in hSCOMT recovery without aggregation. Thus, inclusion of CS basal concentrations and low temperature in HIC strategies resulted in reduced hSCOMT degradation, high enzymatic activity levels and an excellent purity degree, only obtained after two chromatographic steps performed in previous studies.
