Author(s):
Duarte, Andreia Filipa Silvestre
Date: 2016
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.6/4215
Origin: uBibliorum
Project/scholarship:
info:eu-repo/grantAgreement/FCT/5876-PPCDTI/PTDC%2FAGR-ALI%2F121876%2F2010/PT;
Subject(s): Campylobacter; Epidemiologia; Resistência a antibióticos; Resveratrol; Óleo essencial de coentros; Atividade antibacteriana; Atividade anti-biofilmes; Atividade anti-quorum sensing; Potencial antioxidante; Epidemiology; Antibiotic resistance; Coriander essential oil; Antibacterial activity; Anti-biofilm activity; Antioxidant potential; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Outras Ciências Médicas
Description
As doenças de origem alimentar continuam a ser um problema comum em todo o mundo. Ainda que possam ser provocadas por diversos agentes, são as bactérias, os vírus ou os parasitas a principal causa das infeções alimentares. O consumo ou processamento de alimentos contaminados têm sido descritos como as principais vias de transmissão para os humanos. Campylobacter jejuni e Campylobacter coli têm sido descritos como a principal causa de gastroenterite bacteriana em seres humanos em todo o mundo e em 2013, na União Europeia, a campilobacteriose, infeção causada por Campylobacter, foi a zoonose mais relatada. Nos seres humanos, as espécies de Campylobacter têm sido associadas a uma variedade de condições gastrointestinais, tais como gastroenterite, doenças inflamatórias do intestino, cancro colon-rectal, síndrome do intestino irritável, entre outras e também podem provocar manifestações extra-gastrointestinais, como bacteremia, infeções pulmonares e abcessos. As complicações pós-infeção por este microrganismo incluem a artrite reativa e podem conduzir a doenças auto-imunes, tais como a síndrome de Guillain-Barré. A maioria das infeções por Campylobacter não necessita de intervenção terapêutica sendo apenas necessária reidratação. No entanto, em pacientes imunodeprimidos, pacientes cujos sintomas são severos ou persistentes e aqueles com infeções extra-intestinais é utilizado tratamento antimicrobiano, sendo os antibióticos mais utilizados a eritromicina e a ciprofloxacina. No entanto, em todo o Mundo tem-se verificado que as estirpes de Campylobacter são cada vez mais resistentes a antibióticos, incluindo os usados em humanos. Para além disso também têm sido descritas estirpes de Campylobacter resistentes a desinfetantes, o que se deve, principalmente, à sua capacidade de formar biofilmes. Estes biofilmes são um problema emergente na indústria alimentar, aumentando a possibilidade de contaminações ao longo da cadeia alimentar. Assim, e como os estudos relativos a Campylobacter são escassos, é da maior relevância estudar a epidemiologia de espécies de Campylobacter isoladas em Portugal, a sua resistência a antibióticos e procurar alternativas, aos antimicrobianos convencionais, para o seu controlo. Devido à escassez de estudos relativos à epidemiologia de Campylobacter em Portugal procedeu-se neste trabalho ao estudo da distribuição epidemiológica de isolados de Campylobacter de seres humanos, entre 2009 e 2012, em Portugal. Para isso, foram analisadas 837 estirpes obtidas através do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge. Destas 837 estirpes, 84,5% foram identificados como C. jejuni, 14,8% como C. coli, 0,2% como C. upsaliensis, 0,1% como C. concisus e 0,2% das amostras foram identificadas como Arcobacter butzleri. Em relação à sua distribuição por faixas etárias, observou-se que 61,5% das estirpes pertenciam ao grupo com idades entre 1 e 15 anos. Após este estudo preliminar, a partir deste grupo de isolados humanos, escolheram-se aleatoriamente 125 estirpes de Campylobacter (C. jejuni e C. coli) isoladas de seres humanos. A este grupo de estirpes, adicionaram-se 39 isolados de retalho alimentar e 32 de animais. As 196 amostras foram então caracterizadas através da tipagem por sequenciamento multilocus e da tipagem do gene flaA. Através destes métodos de tipagem, observou-se que as estirpes de C. coli eram geneticamente mais conservadas do que C. jejuni e que dentro de cada espécie, existiam isolados geneticamente relacionados provenientes de fontes diferentes. Em seguida, o fenótipo de resistência ao ácido nalidíxico, amoxicilina, ciprofloxacina, eritromicina, gentamicina e tetraciclina foi avaliado pelo método de diluição em agar. Observaram-se elevadas taxas de resistência para todos os antibióticos com exceção à gentamicina, incluindo para os antibióticos utilizados no tratamento de campilobacteriose grave em humanos. Além disso, observou-se um fenótipo de resistência a múltiplos antibióticos (resistência a 3 ou mais classes de antibióticos) em 86% dos isolados. Perante os elevados níveis de resistência observados, estudaram-se os mecanismos moleculares subjacentes a essas resistências. Verificou-se que todos os isolados resistentes à ciprofloxacina possuíam a mutação Thr-Ile-86 na região que determina resistências às quinolonas no gene gyrA. Para a resistência à eritromicina apenas foi detetada a mutação A2075G no gene 23S rRNA. Em relação à resistência à gentamicina, observou-se que as três estirpes resistentes à gentamicina possuíam o marcador de resistência aos aminoglicosídeos aphA-3, sendo que uma das estirpes tinha uma mutação neste marcador. Foi ainda evidenciado neste estudo, que as bombas de efluxo cmeABC também podem desempenhar um papel na resistência a múltiplas drogas e no fenótipo da resistência a gentamicina. Assim, neste estudo foi possível obter uma visão geral da epidemiologia de Campylobacter em Portugal e descrever pela primeira vez a elevada taxa de multirresistência a antibióticos, assim como realçar o surgimento de estirpes de Campylobacter resistentes aos antibióticos de uso humano. Com base nos resultados deste estudo foram selecionadas estirpes com diferentes perfis genéticos e de resistência a antibióticos para serem utilizadas no decurso deste trabalho. Como o género Campylobacter é a principal causa de gastroenterite bacteriana e a via alimentar é a principal via de contaminação, a elevada percentagem de estirpes resistentes a antibióticos aumenta o potencial zoonótico da infeção com estirpes multirresistentes. Logo, torna-se necessário controlar o crescimento de Campylobacter nas vias mais comuns de contaminação, que são os alimentos. Assim, o objetivo seguinte deste trabalho foi avaliar o potencial do resveratrol para controlar as estirpes de Campylobacter previamente caracterizadas. Apesar do resveratrol possuir várias propriedades biológicas, incluindo antimicrobianas, a sua baixa solubilidade em água e alta instabilidade comprometem a sua aplicação. Assim, para ultrapassar estes problemas, estudou-se o encapsulamento do resveratrol com metil-β-ciclodextrina. Verificou-se que a complexação do resveratrol com esta ciclodextrina provocou um aumento de 400 vezes na sua solubilidade. Em seguida o complexo de inclusão foi caracterizado através de Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR), Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC), Difração de Raios-X (XRD) e Microscopia Eletrónica de Varrimentos (SEM), confirmando-se efetivamente a sua formação. Seguidamente foram avaliadas algumas propriedades biológicas do resveratrol e do seu complexo de inclusão com metil-β-ciclodextrina, tendo-se verificado que ambos os compostos tinham atividade antioxidante muito forte, baixa toxicidade e ainda capacidade de reduzir a viabilidade das células Caco-2 (linha celular constituída por células epiteliais de adenocarcinoma colorectal heterogéneo). Além disso, também foi demonstrada a sua atividade antibacteriana contra estirpes de Campylobacter previamente selecionadas: duas estirpes de referência (C. jejuni ATCC 33560 e C. coli ATCC 33559), duas estirpes isoladas de fezes de pacientes com gastroenterite aguda (C. coli 53 e C. coli 873) e duas estirpes isoladas de carne de aves fresca (C. jejuni 225421 e C. coli 219872). Estes resultados sugerem que o resveratrol e o seu complexo de inclusão podem ser usados para controlar Campylobacter e que o resveratrol encapsulado em metil-β-ciclodextrina mantem as suas propriedades antioxidantes e antibacterianas. Uma vez que os resultados com o resveratrol e o complexo de inclusão foram bastante promissores, estudou-se ainda outro complexo de inclusão (resveratrol-hidroxipropil-γ-ciclodextrina), previamente formado e caraterizado pelo grupo de investigação, que revelou ainda ter um potencial antimicrobiano mais elevado contra Campylobacter e A. butzleri, um patogéneo de origem alimentar relacionado a Campylobacter. Dado isto, inicialmente avaliou-se a atividade antibacteriana em células planctónicas e mostrou-se que tanto o resveratrol como o complexo de inclusão têm um efeito bactericida contra as estirpes multirresistentes C. coli 873 e C. jejuni 225421. Com o objetivo de esclarecer o potencial mecanismo de ação do complexo de inclusão do resveratrol em hidroxipropil-γ-ciclodextrina sobre as estirpes de Campylobacter, começou por se avaliar a despolarização das membranas celulares e a atividade metabólica por citometria de fluxo. Através desta técnica, observou-se que complexo de inclusão pode atuar induzindo a despolarização da membrana e afetando a atividade metabólica das células. Dado que os biofilmes bacterianos são um problema emergente na indústria alimentar, também foi avaliado o potencial destes dois compostos para inibir a formação de biofilmes e eliminar biofilmes estabelecidos. Tanto o resveratrol como o complexo de inclusão foram capazes de inibir a formação de biofilmes e diminuir biofilmes previamente estabelecidos, mesmo em concentrações sub-inibitórias. O sistema quorum sensing (QS) tem sido associado à resistência antimicrobiana e formação de biofilmes, portanto, o potencial anti-QS destes dois compostos também foi estudado através da utilização de uma estirpe biossensor (Chromobacterium violaceum ATCC 12472). Verificou-se que ambos, o resveratrol e o complexo de inclusão, foram capazes de inibir o sistema QS, o que pode explicar o efeito anti-biofilme destes compostos. Assim, nestes estudos foram demonstradas as propriedades antimicrobianas e anti-biofilme do resveratrol e complexo de inclusão em estirpes de Campylobacter. Este aspeto associado ao facto de o resveratrol ser um composto de origem natural, e de também apresentar forte atividade antioxidante, encorajam futuros estudos com vista à sua aplicação como potencial conservante alimentar. Finalmente, uma vez que tem havido um interesse crescente na utilização de compostos naturais para aplicação em produtos alimentares, também foi avaliado o potencial do óleo essencial de coentros (Coriandrum sativum L.) e do seu principal composto, o linalool, para controlar Campylobacter. Ambos os compostos exibiram um efeito bactericida contra as quatro estirpes testadas (C. jejuni ATCC 33560, C. coli ATCC 33559, C. jejuni 225421 e C. coli 873) com valores de concentração mínima inibitória entre 0,5 e 1 μL/mL e observou-se que os compostos voláteis do óleo essencial de coentros também inibiram o crescimento de Campylobacter. Observou-se ainda que ambos os compostos inibiram a formação de biofilmes e promoveram a dispersão de biofilmes de Campylobacter. Como descrito anteriormente, também foi estudado o efeito destes compostos sobre o sistema QS. Foi demonstrada a atividade anti-QS do óleo essencial de coentros e do linalool através da inibição da produção de violaceína pela estirpe biossensor C. violaceum. Assim, mais uma vez, esta atividade anti-QS pode estar associada com a atividade anti-biofilme dos compostos, uma vez que o QS tem um papel importante na regulação da formação e desenvolvimento de biofilmes. Para além do potencial anti-bacteriano e anti-biofilme do óleo essencial e do linalool, também se avaliou a sua atividade antioxidante, uma vez que o processo de oxidação está relacionado com a perda da qualidade dos alimentos. Assim, observou-se que ambos os compostos têm uma elevada capacidade para inibir a peroxidação de lípidos. Em suma, os resultados demonstraram que estes compostos naturais podem ser utilizado para controlar Campylobacter e também como agentes antioxidantes para melhorar a qualidade dos alimentos. Em conclusão, neste trabalho, foram apresentados, dados recentes referentes à epidemiologia de Campylobacter em Portugal, bem como a sua diversidade genética e respetivos perfis de resistência a antibióticos. Diante disto, são necessários novos agentes antimicrobianos para controlar este patogéneo emergente de origem alimentar. Neste trabalho mostrou-se que o resveratrol e o óleo essencial de coentros, ambos compostos naturais, têm a capacidade de reduzir células planctónicas e biofilmes de Campylobacter, possuindo também várias atividades biológicas, incluindo propriedades antioxidantes. Este trabalho permitiu alargar o conhecimento sobre a epidemiologia e taxas resistência de estirpes de Campylobacter isoladas em Portugal e desenvolver novas estratégias de controlo deste microrganismo baseadas na utilização de compostos de origem natural.
Foodborne diseases remain common around the world and can be caused by a variety of agents, being bacteria, viruses or parasites the main causes of such infections. Moreover, the major cause of foodborne diseases is consumption or handling of contaminated food. Campylobacter jejuni and Campylobacter coli are the major cause of bacterial gastroenteritis in humans worldwide and are increasingly resistant to antimicrobial agents mainly due to its ability to form biofilms. Furthermore, campylobacteriosis was the most commonly reported zoonosis in the European Union in 2013. So, the main objective of this work was to study the epidemiology of Campylobacter species in Portugal and to explore the potential of natural compounds as new antibacterials to control this foodborne pathogen and to increase the shelf life of food products. We started this work with an epidemiological study of Campylobacter in Portugal. Firstly we studied the epidemiological distribution of Campylobacter isolates from humans, between 2009 and 2012, in Portugal. For this, 837 strains from the National Institute of Health Dr Ricardo Jorge were analyzed, of which 84.5% were identified as C. jejuni, 14.8% as C. coli, 0.2% as C. upsaliensis, 0.1% as C. concisus and 0.2% of the samples were identified as Arcobacter butzleri. Concerning the distribution per age groups, we observed that 61.5% of the strains belonged to the group aged between 1 and 15 years. Afterward, from the group of 837 strains, we randomly choose 125 Campylobacter isolates from humans. In addition to these isolates, we added strains isolated from different sources: 39 from retail food and 32 from animals. All the 196 strains were then characterized by multilocus sequence typing (MLST) and flaA typing. We found that the C. coli isolates were genetically more conserved than C. jejuni, and within each species, genetically related isolates were recovered from different sources. Then, the resistance phenotype to six antibiotics was evaluated by the agar dilution method. We observed high resistance rates to several antibiotics, including the ones used in the treatment of severe campylobacteriosis. We also identified a multidrug resistance phenotype in 86% of the isolates. Once this high resistance to antibiotics was confirmed, we decided to study the underlying molecular mechanisms. In all the ciprofloxacin resistant isolates we found the Thr-86-Ile mutation in the quinolone-resistance-determining regions (QRDR) in the DNA gyrase gene (gyrA). For the erythromycin resistance only the mutation A2075G was detected. Regarding gentamicin resistance, we found the three gentamicin-resistant isolates harboured the aphA-3 aminoglycoside resistance marker, with one strain having a point mutation. In addition, we showed that cmeABC efflux pumps may also play a role in the multidrug resistance phenotype and in the gentamicin resistance. In sum, the results obtained in this first part of the study gave an overview of the Campylobacter epidemiology in Portugal and worrying antibiotic multi-resistance rate. This part also highlighted the emergence of Campylobacter strains resistant to antibiotics commonly used in humans. Then, we select a group of strains with different genetic and antibiotic profiles to be used in the subsequent steps of our work. Since the main source of Campylobacter infection is through contaminated food, it is necessary to find new strategies to control the growth of Campylobacter in the most common way of contamination, which are foods. So, in the next step we assessed the potential of resveratrol to control the strains of Campylobacter that were characterized previously. However, despite resveratrol having several biological properties, its low aqueous solubility and high instability compromise its application. So, to overcome these limitations, we studied the encapsulation of resveratrol with a methyl-β-cyclodextrin. We found that resveratrol complexation caused a 400 fold improvement in its solubility. The inclusion complex was characterized by several techniques. After the formation of the inclusion complex, we compared the biological properties of resveratrol and its inclusion complex. We showed that both compounds had very strong antioxidant activity and low toxicity, together with the ability to reduce the viability of Caco-2 cells (heterogeneous human epithelial colorectal adenocarcinoma cell line). In addition, we also demonstrated their antibacterial activity against the previously selected Campylobacter strains. These results suggest that resveratrol and its inclusion complex can be used to control Campylobacter, since the biological properties are maintained. Due to the very good results obtained with resveratrol and this inclusion complex, we decided to study another inclusion complex (resveratrol-hydroxypropyl-γ-cyclodextrin) and its potential to control Campylobacter and A. butzleri, a closely related foodborne pathogen. Firstly we evaluated the antibacterial activity against planktonic cells, demonstrating that both resveratrol and inclusion complex have a bactericidal effect against the two microorganisms. The inclusion complex may act by inducing membrane depolarization and by affecting the metabolic activity of the cells. Since bacterial biofilms are an emerging problem in the food industry, we also evaluated the potential of these two compounds against biofilms. We showed that resveratrol and the inclusion complex inhibit biofilm formation and diminish established biofilms, even at sub-inhibitory concentrations. Since the quorum sensing (QS) system has been associated with the antimicrobial resistance and biofilm formation, we also evaluated the potential anti-QS effect of these two compounds by using a biosensor strain. We found that both resveratrol and inclusion complex were able to inhibit the QS system, which could explain their anti-biofilm effect. The results showed that resveratrol could be used as antibacterial and anti-biofilm agent in the food industry, allowing an improve shelf life and an increase in food safety. Finally, since there has been a growing interest in the use of natural compounds for application in food products, we also evaluated the potential of coriander (Coriandrum sativum L.) essential oil and its major compound linalool to control Campylobacter. Both compounds showed a bactericidal effect against all the tested strains and we observed that the volatile compounds of the coriander essential oil also inhibited the growth of Campylobacter. Then, since biofilms are a growing problem in the food industry, we also evaluated the anti-biofilm activity of these compounds. Both coriander oil and linalool inhibited biofilm formation and promoted biofilm dispersion of Campylobacter biofilms. As previously described, we also studied the effect of these compounds on the QS system and we observed an anti-QS activity by inhibiting the violacein production. So, once more, this anti-QS activity could be associated with the anti-biofilm activity, since QS has been described to regulate the biofilm formation and development. Moreover, in addition to the antibacterial and anti-biofilm potential, we evaluated the antioxidant activity of coriander oil and linalool, since the oxidation process is also associated with the loss of food quality. We observed that both compounds showed an exceptional ability to inhibit lipid peroxidation. Those results demonstrate that these natural compounds could be used to control Campylobacter and as antioxidant to enhance food quality. In sum, in this thesis, we described the recent epidemiology of Campylobacter in Portugal, as well as its genetic diversity and worrying antibiotic resistance rates. In addition, we also demonstrated that resveratrol and coriander essential oil, which are both natural compounds, have the ability to reduce planktonic cells and biofilms of Campylobacter, including the multiresistant strains characterized in the first part of the work. Clearly, the results obtained in this work encourage the future use of these natural compounds to control Campylobacter.
