Author(s): Guerreiro, Lara Sofia Fernandes
Date: 2012
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.5/4589
Origin: Repositório da UTL
Subject(s): Escherichia coli; vitelos; fluoroquinolonas; resistência mediada por plasmídeos; pressão selectiva; calves; fluoroquinolones; plasmid-mediated-resistance; selective pressure
Dissertação de Mestrado em Segurança Alimentar
O conhecimento sobre a presença e frequência de genes de resistência às quinolonas mediada por plasmídeos (RQMP) em estirpes comensais de Escherichia coli de origem bovina é escasso a nível mundial. Foram estudadas um total de 237 amostras de E. coli de vitelos saudáveis previamente isoladas após pressão selectiva in vivo de enrofloxacina (ENR) e caracterizadas quanto à resistência aos antibióticos: 101, 79 e 57 isolados relativos a T0, T1 (6 semanas após administração de ENR) e T2 (10 semanas após administração de ENR), respectivamente. Os isolados foram caracterizados fenotipicamente por determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) para os antimicrobianos ácido nalidíxico (AN), ciprofloxacina (CIP) e levofloxacina (LEV) e os resultados interpretados segundo os critérios epidemiológicos (ECOFF) estabelecidos pelo EUCAST. A frequência de genes de RQMP (qnr, aac(6’)-Ib-cr e qepA) foi determinada através de amplificação por PCR e sequenciação nucleotídica. A proporção de isolados de E. coli resistentes ao AN em T0, T1 e T2 foi de, respectivamente: 52,5% (n=53; CIM 64->256 μg/ml), 100% (n=79; CIM 128->256 μg/ml) e 82,5% (n=47; CIM 128->256 μg/ml). A resistência à CIP em T0, T1 e T2 foi de, respectivamente: 52,5% (n=53; CIM 0,125->256 μg/ml), 100% (n=79; CIM 0,25-128 μg/ml) e 89,5% (n=51; CIM 0,25-64 μg/ml). A resistência à LEV em T0, T1 e T2 foi de, respectivamente: 46,5% (n=47; CIM 0,5-64 μg/ml), 100% (n=79; CIM 0,5-64 μg/ml) e 87,7% (n=50; CIM 0,5-32 μg/ml). No que respeita aos determinantes de RQMP nos 237 isolados estudados, foram identificados: 11,8% (n=28) positivos para genes qnr (qnrB2, n=4; qnrD, n=11; qnrS1, n=13); e 0,8% (n=2) isolados positivos para o gene aac(6’)-Ib-cr. Da análise da frequência dos genes de RQMP nos isolados de E. coli observou-se: em T0, 3% de genes qnr (todos qnrS1) e 2% do gene aac(6’)-Ib-cr; em T1, 15,2% de genes qnr (10,1% qnrD e 5,1% qnrS1); em T2, 22,8% de genes qnr (7% qnrB2, 5,3% qnrD e 10,5% qnrS1). Os dados obtidos evidenciam um aumento significativo da prevalência de isolados resistentes ao longo do tempo de colheita, sugerindo que a pressão selectiva imposta pela exposição à ENR tem influência no aparecimento de resistência às quinolonas. Observou-se um aumento significativo da frequência de genes de RQMP ao longo do estudo longitudinal e mais de 80% dos isolados positivos para RQMP foram resistentes às quinolonas. Este é, para o nosso conhecimento, o primeiro estudo que descreve a identificação de resistência às quinolonas por qnrD em isolados de E. coli de bovinos.
ABSTRACT - The current knowledge about the presence and frequency of pasmid-mediated quinolone resistance (PMQR) genes in commensal Escherichia coli strains from cattle is scarce. Two hundred and thirty seven E. coli samples isolated from healthy calves were studied after in vivo enrofloxacin (ENR) selective pressure and previously characterized regarding antimicrobial susceptibility, including: 101, 79 and 57 isolates from T0, T1 (six weeks after ENR administration) and T2 (10 weeks after ENR administration), respectively. The phenotypic characterization was performed using Minimum Inhibitory Concentration (MIC) determinantion for nalidixic acid (NAL), ciprofloxacin (CIP) and levofloxacina (LEV) by the microdilution method and the results were interpreted according to EUCAST definitions of epidemiological cut-off values (ECOFF). PMQR genes (qnr, aac(6’)-Ib-cr and qepA) frequency was performed by PCR amplification and nucleotide sequencing. NAL resistant E. coli isolates in T0, T1 and T2 were, respectively: 52,5% (n=53; MICs 64 to >256 μg/ml), 100% (n=79; MICs 128 to >256 μg/ml) and 82,5% (n=47; MICs 128 to >256 μg/ml). CIP resistant isolates in T0, T1 and T2 were, respectively: 52,5% (n=53; MICs 0,125->256 μg/ml), 100% (n=79; MICs 0,25-128 μg/ml) and 89,5% (n=51; MICs 0,25-64 μg/ml). LEV resistant isolates in T0, T1 and T2 were, respectively: 46,5% (n=47; MICs 0,5-64 μg/ml), 100% (n=79; MICs 0,5-64 μg/ml) and 87,7% (n= 50; MICs 0,5-32 μg/ml). From the 237 E. coli isolates tested: 11,8% (n=28) harboured qnr genes (qnrB2, n=4; qnrD, n=11; and qnrS1, n=13) and 0,8% (n=2) were found positive for the aac(6’)-Ib-cr gene. The analysis of PMQR genes in E. coli at the different sampling times showed that: at T0, qnr genes were detected in 3% of the isolates (all found to be qnrS1) and 2% carried the aac(6’)-Ib-cr gene; at T1, 15,2% of the isolates carried qnr genes (10,1% qnrD and 5,1% qnrS1); and at T2, 22,8% of the isolates were found positive for qnr genes (7% qnrB2, 5,3% qnrD and 10,5% qnrS1). The results reveal an increased prevalence of resistant isolates along the time, suggesting that ENR selective pressure influences the emergence of quinolone resistance. A significant increased frequency of PMQR genes along the longitudinal study was observed and more than 80% of PMQR positive isolates were quinolone resistant. This is to our knowledge the first report on PMQR qnrD gene in E. coli isolates from cattle.
