Author(s): Alves, Renato Manuel Pereira
Date: 2008
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10773/3012
Origin: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Subject(s): Métodos biomoleculares; Mitocôndria; Proteómica; Sistema músculo-esquelético; Envelhecimento
Este trabalho teve como objectivo determinar de que forma o envelhecimento afecta o proteoma mitocondrial do músculo-esquelético. Para tal, foram analisadas (i) alterações na composição (ii) variações da actividade dos complexos da cadeia respiratória, (iii) a oxidação de proteínas mitocondriais e (iv) os locais específicos de oxidação dos Complexo I da Cadeia de Transporte de Electrões (ETC). Simultaneamente, verificou-se de que forma o estilo de vida sedentário vs. não-sedentário pode condicionar cada um dos parâmetros observados. Para atingir estes objectivos ratinhos C57BL/6 machos foram sujeitos a um protocolo para simular o envelhecimento sedentário e não-sedentário. Os animais foram depois sacrificados e isoladas as mitocôndrias dos músculos dos membros traseiros. As proteínas mitocondriais foram depois separadas por 2D-PAGE e identificadas por espectrometria de massa. Após a comparação dos perfis de 2D-PAGE pode-se observar que a maioria das proteínas analisadas se encontra sobre-representadas no proteoma mitocondrial de ratinhos sedentários. Para avaliar se estas diferenças se correlacionavam com eventuais alterações na actividade dos complexos da cadeira respiratória, estes foram separados por BN-PAGE e corados com soluções específicas para determinar a sua actividade. Verificou-se uma diminuição na actividade dos complexos IV e V da cadeia respiratória que parece indicar que o aumento da quantidade de proteínas dos complexos da ETC no proteoma mitocondrial surge como um mecanismo de compensação para suprimir a diminuição da actividade da cadeia respiratória. Como parâmetro de oxidação proteica foi determinado o conteúdo em grupos carbonilos das amostras por slot blot. Verificou-se que há uma diminuição significativa do conteúdo em grupos carbonilos nas proteínas dos ratinhos que foram sujeitos a um estilo de vida não-sedentário. Para determinar os locais de oxidação do Complexo I da ETC, as sete subunidades deste complexo, identificadas previamente, foram sujeitas a espectrometria de massa tandem. Foram detectadas modificações em vários péptidos, sendo os resíduos de triptofano mais afectados pela oxidação. Contrariamente ao esperado, as subunidades membranares apresentaram-se mais modificadas que as subunidades mais próximas do centro catalítico. Os resultados permitem sugerir que as subunidades membranares são mais tolerantes aos efeitos da oxidação e que as subunidades do Complexo I podem ser substituídas individualmente quando são danificadas pelos efeitos da oxidação. Globalmente podemos concluir que a realização de actividade física moderada previne os efeitos do envelhecimento, nomeadamente a nível de danos oxidativos nas proteínas mitocondriais. ABSTRACT: This work aimed to assess how aging influences the skeletal muscle mitochondrial proteome. To achieve this, we have analyzed (i) alterations on its composition, (ii) variations on the activity of the respiratory chain complexes, (iii) the oxidation of mitochondrial proteins and (iv) the specific sites for oxidative modification on Complex I from the Electron Transport Chain (ETC). Simultaneously, we assessed how these parameters may be conditioned by a sedentary vs. a non-sedentary lifestyle. C57BL/6 male mice were subjected to a protocol to simulate sedentary and non-sedentary aging. The animals were then sacrificed and mitochondria from the hind limbs muscles were isolated. Mitochondrial proteins were resolved by 2D-PAGE and identified by mass spectrometry. Following a comparison of the 2DE profiles, we have observed that most of the analyzed proteins were up-regulated in sedentary mice mitochondrial proteome. To assess if these alterations were related to any functional variations, the respiratory chain complexes were resolved by BN-PAGE and differentially stained to determine the in-gel activity. We observed a reduction of the activity of Complexes IV and V in sedentary mice, which may suggest that the up-regulation of the respiratory chain complexes in sedentary mice may be a mechanism to overcome the loss of functionality. To assess the level of oxidative stress, we have determined the carbonyl content by slot blot and observed a significant decrease in the carbonyl content of non-sedentary mice. To locate the precise sites for oxidative damage in Complex I of the ETC, the seven subunits of this complex, previously isolated by 2D-PAGE, were subjected to tandem mass spectrometry. We have detected several modified peptides, with tryptophan being the most affected residue. Unexpectedly the membrane subunits presented more modification sites than the peripheral arm subunits. These results may suggest that membrane subunits are more tolerant to oxidative damage and Complex I subunits may be replaced by newly synthesized ones when oxidative damage becomes unbearable. In conclusion, we may assume that moderate physical activity attenuates the effects of aging, namely the oxidative damage of mitochondrial proteins.
