Author(s): Pires, Virgínia Maria Rico
Date: 2008
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.5/226
Origin: Repositório da UTL
Subject(s): Módulos de ligação a hidratos de carbono; C. mixtus; C. thermocellum; Coesina do tipo II; Lupinus albus; α-galactosidases; Carbohydrate-binding modules; Cohesin Type II
Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias. Especialidade em Ciência e Tecnologia Animal
As glicósido hidrolases modulares, que atacam polissacáridos estruturais, possuem módulos não catalíticos de ligação a hidratos de carbono (CBMs) que desempenham uma função crucial na acção destas enzimas por possibilitarem um contacto prolongado da enzima com o substrato. Neste trabalho descrevem-se as características bioquímicas e estruturais de dois CBMs: o módulo C-terminal da Cel5B do Cellvibrio mixtus, o CmCBM6-2, e um CBM da família 11 do Clostridium thermocellum, o CtCBM11. Os resultados indicam que o CmCBM6-2 pode ligar-se a glucanos de ligações β-1,4 ou β-1,3 na fenda A e na fenda B, e que ambas as fendas são necessárias para a ligação à celulose insolúvel. Contudo, apenas a fenda B interage com as regiões internas dos glucanos de ligações β-1,3-1,4, suportando a hipótese de que a variação da especificidade em membros da família CBM6 reflecte a funcionalidade diferenciada das duas fendas de ligação. O CtCBM11 possui uma preferência específica para glucanos de ligações mistas β-1,3-1,4 e revelou possuir uma única fenda de ligação que pode acomodar glucanos contendo ligações tanto mistas β-1,3-β-1,4 como ligações exclusivas β-1,4. No C. thermocellum, tal como noutros microrganismos anaeróbios, o celulossoma consiste num complexo multi-enzimático de celulases e hemicelulases que é organizado pela interacção do módulo coesina com os módulos doquerina presentes nas subunidades catalíticas. Neste trabalho apresenta-se a estrutura tridimensional da coesina do tipo II da SdbA do C. thermocellum, que possui uma elevada homologia com as coesinas do tipo I. Propõe-se que o local de ligação à doquerina está conservado em ambas as proteínas. Finalmente, estudou-se o efeito da suplementação enzimática de uma dieta à base de Lupinus albus para leitões. A suplementação enzimática não apresentou efeitos significativos na digestibilidade ileal aparente da proteína bruta e na digestibilidade ileal verdadeira dos aminoácidos, mas a digestibilidade ileal da fracção fibra neutro detergente aumentou, o que sugere uma actividade residual das hemicelulases presentes nos preparados de alfagalactosidases utilizados.
ABSTRACT: Modular glycoside hydrolases that attack recalcitrant polymers generally contain noncatalytic carbohydrate-binding modules (CBMs), which play a critical role in the action of these enzymes by directing the appended catalytic domains onto the surface of their substrates. Here we report the biochemical and structural properties of two CBMs. The CmCBM6-2, located at the C-terminus of Cellvibrio mixtus endoglucanase 5B was shown to contain two binding sites that display differences in ligand specificity, supporting the view that distinct binding clefts with different specificities can contribute to the variation in ligand recognition displayed by family 6 CBMs. In addition, the family 11 CBM (CtCBM11) from Clostridium thermocellum bifunctional lichenase-celulase enzyme Lic26A-Cel5E, demonstrated a preference for mixed linked glucans and contains a single ligand-binding site that displays affinity for both β-1,4- and β-1,3-1,4- mixed linked glucans. This enzyme is part of the cellulosome which represents an efficient multi-enzyme complex of cellulases and hemicellulases for the hydrolysis of cellulose. Cellulosome assembly results from the interaction of cohesin with dockerin modules present in the catalytic units. Here we report the crystal structure of the Type II cohesin (CohII) from C. thermocellum cell surface anchoring protein SdbA. The structure of CohII is very similar to the Type I cohesin and the dockerin binding site is likely to be conserved in the two proteins. Finally, in this study the effect of supplementing a lupin based diet for piglets with α-galactosidases was evaluated. Enzyme supplementation had no significant effect on the apparent ileal digestibility of crude protein and true ileal digestibility of amino acids, but the ileal digestibility of NDF (neutral detergent fibre) was increased, which suggests a residual hemicellulase activity in the α-galactosidases used.
A candidata foi financiada pela Fundação para a Ciência e Tecnologia, Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior, através do programa POCI, no âmbito do III Quadro Comunitário de Apoio, comparticipado pelo Fundo Social Europeu e por fundos nacionais do MCTES, referência: SFRH/BD/12562/2003
SFRH/BD/12562/2003
