Produção de voláteis por culturas de raízes transgénicas de Anethum graveolens:influência da regeneração e da capacidade de biotransformação

• Autor(es): Faria, Jorge Miguel Silva
• Data: 2008
• Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10451/1362
• Origem: Repositório da Universidade de Lisboa
• Assunto(s): Biotecnologia; Transgénicos; Teses de mestrado
• Tipo de Documento: Dissertação de mestrado
• Idioma: Português
• Orientador(es): Pedro, Luís Manuel Gaspar
• Contribuidor(es): Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição

Tese de mestrado, Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia), 2007, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências

Foram usadas culturas de raízes transgénicas (r.t.) de Anthum graveolens para testar a possibilidade de regeneração e para avaliar a influência da capacidade de biotransformação dos álcoois monoterpénicos, mentol e geraniol, no crescimento e produção de voláteis. A regeneração foi ensaiada em fotoperíodo, de 24h luz em jiffy pellets e de 16h luz em caixas de Petri com 20 ml de meio MS/2. Parte destas foi suplementada com higromicina B (2 mg.l-1, 5 mg.l-1 e 7 mg.l-1) ou ácido salicílico (0,3; 0,5 e 0,8 mM). Outras foram tratadas com radiação UV-C (30 min, 30+15 min, 30+2x15 min, 30+3x15 min), posteriormente à inoculação com extremidades de r.t. A influência da biotransformação foi analisada pela adição de substrato às culturas 15 dias após a inoculação, numa concentração de 25 mg.l-1. As culturas foram mantidas em meio SH, sob escuridão permanente a 24ºC, com agitação a 80 r.p.m. A avaliação do crescimento foi efectuada pelo método da desassimilação e pela medição do peso fresco e peso seco das raízes ao longo de 7 semanas. A componente volátil, extraída por destilaçãoextracção, foi analisada por CGL e CGL-EM. A regeneração não foi conseguida. As r.t. submetidas a fotoperíodo de 16h luz revelaram crescimento, reverdecimento e formação de tecido caloso. Estas respostas não foram observadas com a aplicação de higromicina B ou ácido salicílico nem com o ensaio em jiffy pellets. Estas condições parecem ser prejudiciais ao crescimento. A componente volátil constitutiva das r.t. de A. graveolens é composta, em mais de 50%, por falcarinol (9- 52%), apiole (9-24%), ácido palmítico (7-16%), ácido linoleico (4-9%), miristicina (2-8%) e n-octanal (2-8%). A adição de mentol ou geraniol não influenciou substancialmente o crescimento. Após a adição, a proporção relativa de mentol decresceu rapidamente num período de 48h e observou-se a concomitante produção de acetato de mentilo. O geraniol adicionado foi biotransformado em, pelo menos, 10 produtos, os álcoois linalol, α-terpineol e citronelol, os aldeídos neral e geranial, os ésteres acetato de citronelilo, de nerilo e de geranilo e os óxidos de nerol e linalol. A proporção relativa de geraniol decresceu rapidamente num período de 48h em detrimento dos produtos. A concentração relativa de todos os produtos de biotransformação detectados diminuiu gradualmente ao longo do tempo de cultura

Anethum graveolens hairy root cultures were used to assess regeneration and evaluate the influence of the biotransformation capacity of the monoterpene alcohols, menthol and geraniol, on growth and production of volatile compounds. Regeneration was assayed in photoperiod, 24h light in jiffy pellets and 16h light in Petri dishes with 20 ml of MS/2 medium. Some of these were supplemented with higromycin B (2 mg.l-1, 5 mg.l-1 e 7 mg.l-1) or salicylic acid (0,3; 0,5 e 0,8 mM). Others were subjected to UV-C radiation (30 min, 30+15 min, 30+2x15 min, 30+3x15 min) after inoculation with hairy root tips. The biotransformation capacity was assayed by adding substrate, 25 mg.l-1, to the cultured roots 15 days after inoculation. The cultures were maintained in SH medium, in permanent darkness, at 24ºC, and 80 r.p.m. Hairy root growth was measured by the dissimilation method and by fresh and dry weight measurement, throughout 7 weeks. The volatile component, extracted by distillation-extraction, was analyzed by GC and GC-MS. Regeneration was not achieved. The 16h light photoperiod roots showed growth, regreening and calli formation. These responses were not observed in higromycin B or salicylic acid treated roots or in jiffy pellets. These conditions appear to be disadvantageous (harmful) to growth. The constitutive volatile component of A. graveolens hairy roots is composed, in more than 50%, by falcarinol (9-52%), apiole (9-24%), palmitic acid (7-16%), linoleic acid (4-9%), miristicin (2-8 %) and n-octanal (2-8%). The addition of menthol or geraniol did not substantially influence growth. After addition, the relative concentration of menthol quickly decreased in a period of 48h, and a concomitant production of menthyl acetate was observed. This was the only detectable biotransformation product and its relative amount diminished gradually throughout culture time. The added geraniol was biotransformed in, at least, 10 products, the alcohols linalool, α-terpineol and citronellol, the aldehydes neral and geranial, the esters citronellyl, neryl and geranyl acetates and linalool and nerol oxides. The relative proportion of geraniol quickly decreased in a period of 48h at the expense of the products. The relative concentration of all the detected biotransformation products decreased gradually over time in culture