La Organización Internacional de Normalización, comúnmente conocida como ISO, es una federación de organismos nacionales de normalización de 110 países de todo el mundo con la misión de promover el desarrollo de la normalización y facilitar el intercambio internacional de bienes y servicios. Las normas ISO son elaboradas por comités internacionales que a su vez cuentan con el apoyo de muchos comités técnicos de los países miembros de ISO. La norma ISO/IEC 17025 aceptado en todo el mundo, es el documento principal que comprende los requisitos generales para reconocer la competencia técnica, así como la gestión de la calidad de los laboratorios de prueba y análisis forense. Algunos de los beneficios de su implementación incluyen una mayor confianza del personal en su trabajo y la acreditación mediante un escrutinio calificado por un tercero externo creíble, contribuyendo a una mayor seguridad y credibilidad para todos los que se benefician de estos resultados. En los laboratorios de genética y biología forense, dado que trabajan con procesos sensibles, es fundamental implantar un sistema de calidad que garantice la calidad e imparcialidad de los resultados. Este sistema de calidad debe incluir, no sólo la determinación de los perfiles genéticos, sino también las pruebas necesarias para determinar la naturaleza de las muestras biológicas. En el laboratorio de Genética y Biología Forense de Lisboa, la validación consiste en demostrar, a través de pruebas objetivas, que es adecuado para la finalidad prevista. Este laboratorio valida métodos no normalizados para confirmar su idoneidad. Debido a las diferencias entre los distintos métodos de ensayo, los parámetros a validar dependen de las características del ensayo, y no se propone una única forma de validación. El objetivo de esta presentación, es exponer las metodologías implementadas en este laboratorio para la validación y acreditación de pruebas de orientación y certeza, que permitan determinar la naturaleza de las muestras biológicas estudiadas en casos criminales.

Introduction and Aim: The use of hair samples to determine ketamine (K) and its metabolite, norketamine (NK), has been studied by several authors, using different clean-up approaches. However, microextraction by packed sorbent (MEPS), a miniaturized form of the classic solid-phase extraction has not been applied to date for the purpose. Therefore, a method to determine K and NK in hair samples was developed, optimized, and validated using MEPS as sample clean-up. Materials & Methods: Hair samples were scissor-cut into small fragments, and rinsed with methanol to remove dirt and externally deposited material. Following an overnight incubation with methanol at 65 ºC (no stirring), the compounds were analysed by GC-MS/MS without the need of derivatization procedures; MEPS conditions were: conditioning (5 x 250 µL of methanol and 4 x 250 µL of deionized water); load (10 x 150 µL of hair extract); washing (50 µL of 0.1% acetic acid and 50 µL of 10% methanol); and elution (100 µL of 3% ammonium hydroxide in methanol). Results & Discussion: The procedure resulted in acceptable recoveries, 39-61% for K and 32-43% for NK, and allowed reaching limits of quantification (LOQs) of 50 pg/mg for both analytes. The analytical method presented acceptable accuracy and precision with coefficients of variation typically lower than 15% and BIAS within ± 15%, except at the LOQ (20%). The method was successfully applied to 2 authentic samples, and ketamine concentrations were below 0.05 and 0.18 ng/mg. Norketamine was not detected. Conclusions: This work is the first analytical method using MEPS coupled to GC-MS/MS for the determination of K and NK in hair samples. Following a comparison with a SPE-based method using authentic samples, it was considered rapid and suitable for routine analysis. Acknowledgments: FCT (UIDB /00709/2020 and UIDP/00709/2020). A.Y. Simão acknowledges the PhD fellowship from FCT (2020.09070.BD).

Chromatography plays a fundamental role in forensic toxicology, serving as a powerful analytical tool for identifying and quantifying toxic substances in biological samples. Indeed, it is the science of separation, and it is used to isolate components from complex mixtures. Gas and liquid chromatography instruments coupled with mass spectrometry equip forensic laboratories nowadays, and enable accurately identifying and quantifying drugs and metabolites in several biological specimens, from the most common blood and urine to the unconventional oral fluid and hair samples. These techniques allow the efficient separation of the compounds of interest from endogenous interferences (e.g. proteins, lipids) and their detection. For most substances of toxicological interest, this detection is performed by mass spectrometry, as only this highly selective and sensitive technology is capable of unequivocally identifying the substances present in a sample, allowing obtaining forensically valid and sound results. In this talk, practical routine cases will be presented and discussed.

La genética forense consiste en la aplicación del análisis genético de la diversidad humana para la resolución de ciertos problemas judiciales, mediante la capacidad de relacionar a una persona con un caso concreto, ya sea de derecho civil o penal. Son dos los tipos de pericias más comunes en los laboratorios de Genética Forense: La investigación biológica de Paternidad y la Criminalística Biológica. En las investigaciones de paternidad, el ejemplo más simple y común es si un hombre es el padre biológico de un niño, e implica pruebas de ADN de la madre, el niño y el presunto padre juntos. En los últimos años, se ha producido un aumento de las solicitudes para determinar la filiación utilizando diferentes miembros de la familia, lo que siempre requiere una evaluación estadística de estas pruebas. En estos casos, la fuerza de la evidencia de los datos de ADN (LR- Likelihood Ratio) a menudo puede ser mucho más débil que en los casos de paternidad de trío y no proporciona evidencia sólida a favor o en contra de la paternidad. Actualmente, los mayores desafíos son los cálculos complejos, en los que los perfiles genéticos autosómicos STRS no son suficientes y se requiere más información, incluso con X-STRs, Y-STRs, o incluso más marcadores genéticos. En los casos criminales, el perfil genético obtenido a partir de las muestras problema se compara con el perfil genético de víctimas y sospechosos. En estos casos, la valoración estadística mediante el cálculo de LR (Likelihood Ratio) en cuenta el número de posibles contribuyentes a un perfil genético determinado. El objetivo de esta presentación es exponer, analizar y aplicar la razón bayesiana de probabilidad para estimar el valor de las pruebas de ADN en algunos casos complejos de paternidad y criminales.

A toxicologia forense desempenha um papel crucial na análise abrangente de uma diversidade de substâncias presentes em diversas amostras biológicas e não biológicas, focando-se na interpretação de resultados em contexto médico-legal. São realizadas análises qualitativas e quantitativas, com o propósito de contribuir para o esclarecimento do possível envolvimento dos compostos detetados nos casos sob investigação. Nesse sentido, o toxicologista forense desempenha um papel fundamental na identificação das causas e circunstâncias de intoxicação ou morte, utilizando a análise de fluidos e órgãos obtidos durante autópsias médico-legais. No âmbito do Serviço de Química e Toxicologia Forenses, são apresentadas análises relacionadas a casos de mortes associadas ao consumo direto e indireto de drogas de abuso. Os casos menos frequentes representam um desafio significativo para o toxicologista forense, sendo considerados de elevado valor científico e proporcionando uma oportunidade valiosa de aprendizagem para toda a comunidade médico-legal.

A Base de Dados de Perfis de ADN (BDP ADN) encontra-se consagrada na legislação portuguesa desde 2008, contudo somente em 2010 foi inserido o primeiro perfil genético. Desde então o número de inserções e o seu papel tem aumentado substancialmente. A Lei n.º 5/2008, de 12 de fevereiro, que aprova a criação e rege o funcionamento da BDP ADN, permite a inserção de perfis de ADN de "arguido condenado por crime doloso com pena concreta de prisão igual ou superior a 3 anos" (art. 8º, nº 2), assim como de "arguido declarado inimputável a quem seja aplicada a medida de segurança de internamento" (art. 8º, nº 3). A inserção destes perfis tem como principal objetivo auxiliar a resolução de outros quesitos pelo meio de coincidências, assim como, servir como fator dissuasor da criminalidade. Com este trabalho pretendeu-se descrever e analisar o retrato de um condenado reincidente na BDP ADN. De forma a concretizar este trabalho, foram analisados e deviamente anonimizados os registos dos indivíduos condenados presentes na BDP ADN até à data de 31 de dezembro de 2023. Desta lista foram selecionados somente os condenados reincidentes, que representam um total de 1178 indivíduos. Posteriormente, com recurso ao software Microsoft Excel, os dados obtidos, nomeadamente, idade, sexo, nacionalidade, Comarca e tipo de crime, foram analisados permitindo a caracterização da população em estudo. Com base nos 1178 registos obtidos, foi possível depreender que na sua maioria o condenado reincidente é homem, com idade compreendia entre os 30 e os 49 anos e de nacionalidade portuguesa. Verificou-se que 27% dos condenados reincide numa Comarca distinta e que os crimes mais prevalentes são os crimes contra a propriedade, o tráfico de estupefacientes e os crimes contra a integridade física. Da análise dos tipos de crime cometidos pelos indivíduos condenados reincidentes na BDP ADN, foi possível observar, entre outros, que os condenados por práticas de crimes contra a autodeterminação sexual (vítimas com idade inferior a 18 anos), reincidiram na prática criminosa antes do processo comum da acusação inicial ter transitado em julgado ou, posteriormente, no decurso do cumprimento de uma pena suspensa. Adicionalmente, os dados referentes a indivíduos condenados, primeiramente, pela prática de violência doméstica e, de seguida, pela prática de um crime de homicídio, na forma tentada ou consumada, demonstraram que o crime contra a vida foi praticado após a apresentação de queixa pela vítima de violência doméstica e antes do processo comum ter transitado em julgado. Em conclusão, este trabalho permitiu caracterizar o perfil de um condenado reincidente em Portugal.

DNA typing, since it was introduced, in the mid-1980s, has revolutionized forensic science and the ability to link an individual to a judicial proceeding under civil or criminal law. Forensic genetic analysis involves procedures from sample collection and storage, DNA extraction and quantification (whenever it is deemed necessary), amplification of the genetic markers, and subsequent analysis of these amplified products A forensic genetic profile, represented in an electropherogram, corresponds to a graphic representation that relates time/size and fluorescence intensity at various wavelengths of light of these amplified products. Statistical analysis of genetic profiles related to the same process is preponderant for evidence evaluation and report drafting. In paternity investigations, the simplest and commonest example is whether a man is the biological father of a child, and it involves, DNA tests of the mother, child, and alleged father together. In recent years, there has been an increase in testing how a set of persons are related. In these cases, the strength of the evidence from DNA data may often be much weaker than in trio paternity cases and it doesn´t provide strong evidence for or against paternity. The greatest challenges today, are complex calculations, in which the autosomal STRS genetic profiles are not enough, and more information is required, including with X -STRs (X-chromosome markers) or Y -STRs (Y-chromosome markers) or even more genetic markers. Regarding trace samples, collected in criminal cases, or collected from suspects or victims and crime scenes represent greater challenges. Recent advances in DNA typing technologies have led to analysis of increasingly complex DNA mixtures of two, three, or even more contributors, commonplace in casework, but with challenging interpretation, and in many cases the forensic scientist questions if these complex STR profiles, with high and/or low template component mixed samples should be analyzed. Guidelines for mixture interpretation, have been published by different entities, in order to, obtain some kind of consensus in the evaluation of these genetic profiles. Tree kinship cases and tree criminal cases, with STR results and reported conclusions, will be presented to illustrate different challenging situations in the evaluation of genetic profiling evidence. In the near future, biggest challenges will be posed concerning genetic information from new MPS (Massive parallel sequencing equipment) and the developing of the new integrative statistical framework with prototype software for combined appearance, age, and ancestry prediction, allowing constructing of composite sketches from DNA and then assessing how this information can be included in the expert reports.

O estudo do ADN antigo baseia-se em estratégias metodologicamente inovadoras e cumulativas, que visam a reconstrução genética de populações passadas a partir de fragmentos ósseos humanos com intervalos post mortem que variam entre centenas e milhares de anos. O procedimento laboratorial envolve etapas como a limpeza e fragmentação das amostras ósseas e dentárias, a extração, quantificação, amplificação, sequenciação e análise bioinformática do ADN. A ausência de um protocolo universal para a extração de ADN antigo implica a necessidade de seleção criteriosa do método mais eficaz, de acordo com o contexto da investigação e propriedades da amostra. Neste trabalho, destaca-se a importância da escolha do método de extração como um fator determinante para a obtenção de ADN endógeno em quantidade suficiente e livre de inibidores, permitindo a obtenção de perfis genéticos ou sequências de ADN o mais completos possíveis. O objetivo principal deste trabalho consiste na análise comparativa de diferentes métodos de extração de ADN antigo, com base numa revisão da literatura científica. Os métodos mais frequentemente utilizados incluem métodos orgânicos, de entre os quais o método fenol-clorofórmio, o mais utilizado e que, apesar de laborioso, parece permitir a obtenção de boas quantidades de ADN extraído. Outro conjunto de métodos inclui a utilização de sílica, quer em suspensão, quer em coluna, e que tem um papel importante na fase de separação e purificação do ADN. Para aplicações forenses, têm sido desenvolvidos métodos comerciais, como PrepFiler Express BTA, NucleoSpin DNA Forensic e QIAamp DNA Investigator Kit. Os métodos à base de sílica são geralmente preferidos, embora a utilização de reagentes como DTT e PTB possa diminuir a quantidade de ADN extraído, dado que dificultam a lise proteica ou não promovem a desintegração completa de determinadas moléculas. Uma solução vantajosa parece ser a combinação dos métodos orgânicos e comerciais, permitindo maximizar a quantidade e qualidade do ADN extraído, com vista à definição de um perfil ou sequência consenso. Apesar dos avanços tecnológicos, a degradação e a contaminação continuam a ser dos principais desafios na extração de ADN antigo. A avaliação da eficácia da extração pode ser realizada com base em parâmetros obtidos pela quantificação. De forma a otimizar os recursos, protocolos semi-automatizados podem reduzir os custos e o tempo de análise. Para um melhor entendimento das limitações atuais e aperfeiçoamento das técnicas existentes, torna-se essencial o estudo de diferentes amostras, com origens e tipologias de material ósseo e dentário diversificadas. Ainda que a escolha metodológica deva ser adaptada aos objetivos específicos de cada estudo, a utilização de diretrizes é fundamental para assegurar a comparabilidade interlaboratorial. Neste contexto, revisões de literatura como a presente assumem um papel relevante na orientação de futuras inovações e aplicações na área forense.

Introdução O SGBF-N é um serviço acreditado pelo IPAC, pelo que todos os reagentes e equipamentos em uso têm de ser validados internamente em função do PG-SGBF-001. Recentemente, foi adquirido um novo kit de amplificação, Investigator26Plex QS, que partilha 25 polimorfismos com o PowerPlex Fusion 6C, utilizadoatualmente no SGBF-N, possuindo ainda dois marcadores adicionais de controlo interno de qualidade. Estes possibilitam a avaliação da eficácia da amplificação, a integridade da amostra e a eventual presença de inibidores, apresentando-se como uma potencial alternativa aos kits atualmente em uso. Este trabalho pretende apresentar parte do processo de validação e consequentes resultados obtidos até à data pelo SGBF-N. Material e Métodos Numa primeira análise foram determinados os limiares analíticos, tendo, para tal, sido analisados 50 brancos de amplificação. Para a análise da especificidade foram analisadas diferentes espécies de animais somando 34 amostras no total. As amostras utilizadas para a análise da sensibilidade apresentaram um intervalo de concentração de ADN de 10-0,001ng/μL. De forma a otimizar recursos, foi reduzido o volume final de reação para metade do descrito na bula, assim como foi reduzido o número de ciclos, de 30 para 27. De modo a analisar os parâmetros reprodutibilidade e a repetibilidade, foram analisados o mesmo grupo de amostras em 3 dias diferentes, por 3 operadores diferentes. Em paralelo a todos os ensaios descritos, foram amplificadas amostras de natureza distinta - zaragatoas bucais extraídas com PrepFiler e Prep-n-Go, assim como manchas de sangue recolhidas post mortem e in vivo, extraídas e de forma direta - de modo a garantir que o kit mantém a eficácia. No procedimento laboratorial foram utilizados termocicladores GeneAmp PCR System 9700 e Veriti Thermal Cycler e o sequenciador 3500 Genetic Analyzer. Resultados e Discussão Na análise dos perfis genéticos das amostras animais, observou-se ausência total de amplificação permitindo concluir que o 26plex é exclusivo ao ADN humano. Analisados os resultados da sensibilidade verificou-se que partir da concentração 0,01ng/μl o kit começou a apresentar dropout alélico. Os resultados obtidos quando as mesmas amostras foram analisadas nas mesmas circunstâncias, mas em dias e por operadores diferentes mostraram-se sobreponíveis. A redução da quantidade de reagentes para metade e do número de ciclos para 27 permitiram a obtenção de perfis genéticos com os padrões de qualidade definidos pelo serviço. Conclusões Com os procedimentos efetuados foi possível proceder à otimização do kit, pretendendo continuar a validação futuramente para os parâmetros em falta, nomeadamente, análise de contaminação e presença de inibidores em amostras de referência, determinação de limiares de heterozigotia, entre outros. Com isto espera-se ter uma alternativa acreditada para a análise das amostras recebidas no SGBF-N.