Microextraction by packed sorbent (MEPS) efficiently combines extraction, pre-concentration, and cleanup in a single device comprising two parts: the MEPS syringe and the packed sorbent bed1. MEPS has been used for several bioanalytical applications, including extraction of endogenous metabolites, biomarkers, and drugs from biological samples. It is particularly useful in metabolomics and pharmacokinetic studies2,3. Regarding MEPS applicability to forensic toxicology, urine is the most used specimen, followed by oral fluid (despite of its relatively high viscosity). Protein precipitation followed by centrifugation and with, or without dilution of the supernatant is the most commonly reported approach. The most detected compounds in forensic settings using MEPS are drugs of abuse [opiates and opioids (26%), cocaine (13%) cathinones (11%), dissociative hallucinogens (11%), cannabinoids and amphetamines (9% each) and other drugs (10%)] and medicinal drugs [antidepressants (9%), benzodiazepines/Z drugs (4%)]. MEPS was also applied to a beverage for forensic purposes e.g. to evaluate its composition in drug-facilitated crimes. An important feature in MEPS is the miniaturization of the sorbent. A careful selection of the sorbent will allow working with complex matrices, separating the target analytes from interferences and improve recoveries. The most widely selected sorbent was the silica based C18 that is a popular reversed-phase material (41%). Starting in the 2000s, new modifications of sorbents appeared. Overall, what the future holds for MEPS applications in forensic toxicology is promising, and ongoing research and technological advancements are likely to enhance the capabilities of MEPS approaches, making this technique an increasingly valuable tool for toxicological investigations.

As novas substâncias psicoativas (NPS) são desenvolvidas para mimetizar os efeitos psicotrópicos das drogas clássicas, e sua presença tem vindo a aumentar no mercado de drogas. Estes compostos são facilmente acessíveis (por exemplo, online) e geralmente não são regulamentados pelas políticas internacionais de drogas. Este trabalho descreve o desenvolvimento de um método sensível e específico por LC-MS/MS para deteção de NPS e contaminantes de crack, nomeadamente: 25C-NBOMe; 25E-NBOH; 25B-Nbome; etilona, mefedrona, UR-144, JWH 073; 5F-MDMB-PINACA; 3-MeO-PCP; 5-MeO-DMT; 2C-I; 2-C-C; cetamina, 3,4-MDPHP; canabidiol; estricnina, levamisole e fenacetina. 10 mg de cabelo foram extraídos com uma solução patenteada contendo metanol, ácido fórmico e acetonitrilo, sendo em seguida submetidos a uma filtração com pressão negativa usando placa de filtragem ISOLUTEâ. A análise foi realizada no sistema SciexTriple Quad 5500 com UPLC ExionLC AD. A separação cromatográfica foi realizada a 40 ºC numa coluna Aqcuity BEH C18 2.1x50mm; 1.7 μm i.d. A fase móvel consistiu em 0,1% de ácido fórmico em água (A) e 0,1% de ácido fórmico em acetonitrilo (B), iniciando com 2% de concentração de B até 95% em 1,5min. Esta proporção foi mantida constante até 2 min e de seguida as condições iniciais do método foram reestabelecidas por mais 0,5 minutos. O tempo total de corrida foi de 2.6 minutos. Os compostos foram ionizados por eletrospray em modo positivo em modo MRM com duas transições por analito para identificar e quantificar os compostos. Os parâmetros de ionização da fonte e de fragmentação foram otimizados para obtenção dos melhores resultados. Foi obtida linearidade entre 0,1 a 1 ng/mg para todos os analitos obtendo um coeficiente de correlação superior a 0,99. Os valores ion ratio obtidos também foram satisfatórios, reforçando a confiabilidade dos dados obtidos. Ao testar o efeito matriz, observou-se que a maioria dos analitos não apresentou interferências significativas, garantindo a precisão das análises. O método descrito demonstrou ser eficaz para a deteção de NPS e contaminantes em amostras de cabelo, permitindo a identificação e quantificação precisa de vários compostos de interesse. A utilização de amostras de cabelo como matriz de análise oferece vantagens por ser menos invasiva em comparação com outras amostras biológicas tradicionais, como sangue e urina. A aplicação desse método analítico pode contribuir para aprimorar a monitorização clínica e forense de consumidores de NPS, auxiliando na tomada de decisões relacionadas com a saúde pública e com o controlo de drogas. A crescente preocupação com o uso de NPS exige o contínuo desenvolvimento de métodos analíticos eficazes para enfrentar os desafios emergentes no campo da toxicologia.

Background & Aims: New Psychoactive Substances (NPS) are a real contemporaneous threat, due to their potency, dangerousness, and lack of control/monitoring. The NPS group that has grown the most is the synthetic opioids group, where fentanyl and its analogues stand out. However, the emerging concerning synthetic opioids are nitazenes. Due to their high potency, even minimal consumption doses can lead to severe health effects or even fatal overdoses, making them a public health issue. Notwithstanding, is it also important to remain vigilant towards more “traditional” psychoactive substances like hallucinogens once they have been associated with both intentional and unintentional poisonings/intoxications. This is particularly relevant now that they are also being used for clinical purposes. Therefore, it is essential to establish analytical methodologies for monitoring these compounds. As a result, the aim of this study was to develop, optimize and validate an easy to use, fast, simple, sensitive, robust, and routine flow method for the analysis of new synthetic opioids (fentanyls and nitazenes) and (classic) hallucinogens in whole blood. Methods: The present work describes a method that allows the screening, qualitative confirmation, and quantification of more than 10 psychoactive substances, including new synthetic opioids and hallucinogens. The sample preparation step consisted in 50 µL of whole blood protein precipitation with refrigerated acetonitrile containing formic acid and was optimized using a design of experiments (DoE) approach, namely Full Factorial Design, to achieve the best conditions for compounds extraction from matrix. Following centrifugation, the resulting supernatant extract can be directly injected into an ultra-high-performance liquid chromatograph coupled to a triple quadrupole linear ion trap mass spectrometer (Sciex UHPLC-QTRAP-MS® 6500+) and analyzed in a 5-minute run in Multiple Reaction Monitoring (MRM) mode with 2 transitions for each compound. The developed analytical methodology was fully validated according to the guiding principles of the ANSI/ASB Standard 036. To confirm its applicability in a real context, the proposed methodology was applied to the analysis of authentic forensic samples. Results & Discussion: In terms of validation, the methodology linearity was assessed between 1 and 20 ng/mL. The precision and accuracy were satisfactory, with values <15% and within ±15% (20% at the LOQ), respectively. The limits of detection were between 0.1 and 1 ng/mL, depending on the compound. Dilution ratios were also successfully evaluated. Selectivity was confirmed by analyzing spiked samples containing several therapeutic drugs and other drugs of abuse. Conclusion: The proposed methodology provides a valuable and powerful tool for toxicology laboratory, enabling the simultaneous identification, confirmation, and quantification of different families of psychoactive substances, including synthetic opioids and hallucinogens. Its speed, simplicity, effectiveness, and reliability make it particularly advantageous for routine analysis. These combined advantages make it a suitable alternative for routine implementation.

O presente trabalho tem por objetivo fornecer uma instrução que permita uniformizar os procedimentos a serem realizados por entidades externas ao Serviço de Genética e Biologia Forenses (SGBF) e ao Laboratório de Virologia e Análises Clínicas e Forenses (LV-ACF) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, no que diz respeito à colheita, identificação, acondicionamento e envio de amostras. O âmbito desta instrução aplicar-se-á essencialmente aos Serviços de Clínica e Patologia Forenses e respetivos Gabinetes Médico-Legais e Forenses, envolvidos na amostragem da maioria das amostras. As amostras colhidas poderão ser de referência ou problema, e estar incluídas em processos de investigação de parentesco, investigação individual ou criminalística biológica, em curso no SGBF. As amostras dirigidas ao LV-ACF estão envolvidas nas várias valências dos exames de análises clínicas como Hematologia, Química Clínica, Imunologia, Microbiologia e Genética Humana. A colheita, identificação, acondicionamento e transporte das amostras, assegurando a respetiva cadeia de custódia, é essencial na obtenção e validação dos resultados periciais. Esta apresentação divulgará toda a informação necessária de uma forma clara e apelativa de forma a sensibilizar todas as partes envolvidas. Não se pretende uma descrição exaustiva de um procedimento, mas apenas um esquema prático e simples que facilite a divulgação dos conhecimentos de forma útil.

O consumo de antidepressivos representa uma problemática a nível mundial, apresentando Portugal uma das taxas de prevalência de doenças mentais mais elevadas da Europa. A monitorização terapêutica é uma prática instituída para um pequeno número de fármacos para os quais há uma relação direta entre a concentração e o efeito farmacológico, envolvendo habitualmente a determinação de drogas no soro, plasma ou sangue. O presente trabalho descreve uma metodologia para a determinação de antidepressivos (fluoxetina, venlafaxina, sertralina, citalopram, paroxetina e metabolitos) em fluido oral (250 μL) com recurso à microextração em seringa empacotada (MEPS) e à cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa em tandem (GC-MS/MS). A técnica MEPS foi otimizada utilizando a ferramenta estatística Design of Experiments (DoE). Previamente à MEPS procedeu-se à precipitação proteica do fluido oral com 500 μL de acetonitrilo gelado, após a qual se centrifugou, decantou e se evaporou o sobrenadante. Posteriormente, dissolveu-se o resíduo em 1 mL de tampão fosfato 25 mM (pH 6). A técnica de MEPS otimizada consistiu no acondicionamento com 250 μL de metanol (MeOH) e 250 μL de 0,1% HCOOH em H2O; load de 150 μL da amostra (12×); lavagem com 4x50 μL de HCOOH a 1% em H2O; secagem por aspiração de 4x50 μL de ar; eluição com 4x100 μL 1% NH4OH em MeOH. O eluato foi evaporado e procedeu-se à derivatização por 2 min em microondas a 800 W, após o qual se injetaram 2 μL no sistema cromatográfico. O método foi validado de acordo com as diretrizes internacionalmente aceites da Food and Drug Administration para o intervalo de linearidade entre 10 e 500 ng/mL. Obtiveram-se valores de coeficiente de determinação de pelo menos 0,99 e os valores de erro relativo e coeficiente de variação foram definidos de acordo com os critérios de validação. Os limites de quantificação foram estabelecidos entre os 10 e os 100 ng/mL e as recuperações absolutas variaram entre 12 e 93%. A estabilidade foi estudada para amostras processadas, estabilidade de bancada e ciclos de congelação/descongelação e a metodologia foi aplicada na análise de amostras autênticas de fluido oral. De salientar que este é o primeiro trabalho que utiliza MEPS para determinação de antidepressivos e metabolitos em amostras de fluido oral.

Manuel Bento de Sousa foi um célebre médico da segunda metade do século XIX. A sua ligação à Medicina Legal é indiscutível pois é a figura homenageada na rua onde se encontra instalada a Delegação do Sul do INMLCF, em Lisboa. Porém, esta ligação vai muito além da toponímia. Ao longo da sua vida destacou-se como Clínico, Cirurgião e Professor, dedicando-se também à produção de artigos científicos e à escrita criativa onde se salienta a sua faceta polemista. No âmbito da Medicina Legal, Manuel Bento de Sousa fez parte da equipa que realizou as perícias no mediático "caso Joana Pereira", relativo a uma morte por asfixia (cadáver encontrado em Mafra no ano 1876) em que os suspeitos do crime foram ilibados, o que contrariou as conclusões do relatório pericial, tendo levado a uma discussão científica sobre a possibilidade de suicídio ou homicídio. Mas a ligação deste médico à Medicina Legal não se cinge aos processos onde participou como perito, o que à época era muito pontual, pois décadas antes da publicação da Carta de Lei de 1899, que promoveu a organização da Medicina Legal em Portugal, apresentou uma proposta sobre esta matéria. Em 1865, Manuel Bento de Sousa publicou vários artigos onde criticou o ensino da Medicina Legal, referindo que o mesmo era puramente teórico, defendendo, desta forma, a adoção do modelo Prussiano, adaptando-o à realidade portuguesa. Assim, propõe a criação de laboratórios nas três escolas médicas, que deveriam ser dirigidos pelo professor da disciplina de Medicina Legal e dotados de materiais e preparadores. Este seria o local do ensino prático e pericial onde se realizariam as perícias médico-legais solicitadas pelos tribunais da comarca e onde os estudantes teriam oportunidade de assistir e participar na execução dos exames. Estes espaços deveriam assegurar igualmente os exames de outras comarcas, sempre que envolvessem meios de investigação mais minuciosos não disponíveis nesses locais como, por exemplo, os exames de "veneficio", o que nos remete para as investigações de cariz laboratorial. No âmbito das comarcas fora das áreas escolares, defendia também que deveriam existir médicos adjuntos aos tribunais com remuneração pelo seu trabalho "não ficando dependentes de terem ou não as partes e os réus meios para pagarem", como acontecia naquela época. A ação e as propostas de Manuel Bento de Sousa são marcos importantes na história da Medicina Legal Portuguesa. E apesar da Carta de Lei de 1899 ter ficado aquém das suas ideias, elas vieram a ser recuperadas e valorizadas no início do século XX por Azevedo Neves, estando na base de muito do conteúdo do Decreto 5023 de 1918, que vem depois reorganizar os serviços médico-legais em Portugal, e que em diversos aspetos mantém vivo o que é hoje o ensino e a organização da Medicina Legal nacional.

A capacidade de multiplexação da sequenciação massiva em paralelo (MPS), em simultâneo com a capacidade de análise de diversos tipos de marcadores genéticos, conduziu a genética forense a uma utilização mais frequente dos polimorfismos de nucleotído único (SNPs). Iniciaram-se, também, as análises denominadas Forensic DNA Phenotyping (FDP) que incluem a inferência da ancestralidade biogeográfica (BGA) e a inferência das características visíveis externamente (EVC) a partir de uma amostra biológica. Características que poderão orientar a investigação e a pesquisa em registos, dotando o ADN da capacidade de atuar como testemunha. No entanto, a interpretação de genótipos e haplótipos de BGA pode ser desafiadora, faltando ainda, orientações e harmonização sobretudo sobre a forma de expor os resultados obtidos. Este trabalho tem como objetivos apresentar o método desenvolvido no Serviço de Genética e Biologia Forenses da Delegação do Sul (SBGF-S) para a determinação dos marcadores BGA e EVC; e apresentar um modelo de relatório pericial que pretende explanar os procedimentos a que a amostra foi submetida e traduzir os resultados em conclusões adequadas e percetíveis. Foram analisadas amostras colhidas após consentimento informado livre e esclarecido aprovado pela comissão ética e científica do INMLCF. As amostras foram extraídas com PrepFiler Express BTA™ Forensic DNA Extraction Kit e quantificadas com Quantifiler™ Trio DNA Quantification Kit. A preparação de bibliotecas de 41 SNPs autossómicos informativos para a EVC, 163 SNPs autossómicos de ancestralidade, e 116 Y-SNPs específicos de linhagem paterna incluídos no Ion AmpliSeq™ PhenoTrivium Panel, foi realizada de forma manual. A preparação de bibliotecas de ADN mitocondrial (ADNmt) foi realizada num equipamento Ion Chef™ com o Precision ID mtDNA Whole Genome Panel. A preparação do template e carregamento do Ion 530™ Chip foi realizada num Ion Chef™ utilizando o Ion S5™ Precision ID Chef & Sequencing Kit. A sequenciação foi realizada num Ion GeneStudio™ S5 System. A análise primária da sequência detetada foi realizada no Servidor Torrent em relação ao genoma de referência, hg19. A tipagem genética foi realizada utilizando o plugin HIDGenotyper-2.2 e a previsão BGA foi determinada com o Converge™ Software, baseada num método de bootstrap e um intervalo de confiança de 95%. A população de referência utilizada, compreende sete populações da base de dados ALFRED: África, América, Leste Asiático, Europa, Oceânia, Sul da Ásia e Sudoeste Asiático. A ancestralidade paterna e materna foi determinada recorrendo ao software YLeaf e à base de dados EMPOP, respetivamente. A predição do fenótipo foi obtida usando o Erasmus HPS Webtool. O conjunto dos SNPs autossómicos de ancestralidade, SNPs específicos de linhagem paterna e materna, e SNPs autossómicos fenotípicos, escolhidos, mostraram-se adequados para a determinação da BGA e EVC de uma amostra desconhecida, tendo sido elaborado o relatório pericial modelo.