Author(s): Silva, Francesca Aparecida Ramos da, 1982-
Date: 2019
Persistent ID: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1640186
Origin: Oasisbr
Subject(s): Doença de Crohn; Doenças inflamatórias intestinais; Tecido adiposo; Mesentério; Crohn disease; Inflammatory bowel diseases; Adipose tissue; Mesentery
Orientadores: Raquel Franco Leal, Azucena Salas
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
Resumo: Introdução: A doença de Cohn (DC) é uma doença multifatorial caracterizada por inflamação intestinal crônica. O aumento da adiposidade visceral próxima à área intestinal afetada, da qual o tecido adiposo mesentérico (TAM) é o principal componente, é uma característica da DC. Tanto um papel protetor como patológico tem sido atribuído a esse tecido associado à DC. Objetivo: Compreender a contribuição do TAM para a fisiopatologia da DC, fornecendo um perfil molecular e celular próprios desse tecido na DC. Casuística e Método: A análise transcricional total foi realizada por sequenciamento total de RNA (RNA-seq) do TAM e de mucosa ileal de pacientes com DC em atividade (grupo DC, n=8) e controles sem doença inflamatória intestinal (grupo CTR, n=8). A validação biológica de um painel de genes diferencialmente expressos foi conduzida por reação em cadeia polimerase em tempo real (qPCR) em 26 pacientes com DC e 17 controles. Imuno-histoquímica e imunofluorescência também foram realizadas para análise de validação. Resultados: RNA-seq identificou 17 genes significativamente regulados (|FC|>1,5; FDR<0,05) no TAM associado à DC em comparação com os controles, com um acentuado aumento da expressão de genes relacionados a plasmócitos (i.e., IGLL5, MZB1, CD79A, POU2AF1, FCRL5, JCHAIN, DERL3, SDC1, PIM2). Um valor de corte estatístico menos estrito (|FC|>1,5, p nominal<0,05) revelou uma lista maior, com 651 genes comparando-se o TAM da DC ao controle. A análise da vias (Ingenuity Pathway Analysis) dessa assinatura transcricional revelou regulação significativa de vias relacionadas à função de células T e B. Em contraste com o TAM, a análise transcricional do íleo revelou um conjunto de 849 genes significativamente regulados na DC em comparação com os controles (|FC|>1,5; FDR<0,05), e 2.654 genes ao aplicar o ponto de corte mais baixo (valor nominal de p<0,05). Apesar das diferenças entre o TAM e íleo de pacientes com DC, identificou-se um subconjunto de 204 genes modulados significativamente em ambos os tecidos. Essa assinatura transcricional comum incluiu genes relacionados a plasmócitos (MZB1, POU2AF1, IGLL5, JCHAIN, DERL3 e PIM2) que apresentaram aumento significativo tanto no TAM quanto no íleo de pacientes com DC. Por outro lado, outros genes expressos significativamente no íleo do grupo DC, como S100A8 / S100A9 (calprotectina), IL1B, CD14, CXCL1, CXCL8, MMP1, OSMR, que estão relacionados à resposta inflamatória aguda, apresentaram-se exclusivamente regulados na mucosa ileal na DC, mas não no TAM adjacente. Em contraste, alguns genes que codificam receptores linfocitários estiveram regulados exclusivamente no TAM da DC (MS4A1, CD6, CTLA4, CD3D, CD3E, IL2RG, LAG3-2, CD24, CD79A, CD5 e CD69), mostrando um padrão distinto de ativação de células imunes neste tecido em comparação com o que ocorre na mucosa ileal. qPCR em uma coorte de pacientes e de controles confirmou regulação significativamente positiva de CD79A, SM4A1 (CD20), CTLA4 e CD3D no TAM de pacientes com DC em comparação com os controles, sem diferenças significativas quanto aos níveis de IL1B e S100A8. Por fim, a análise de imuno-histoquímica e de imunofluorescência confirmou grandes infiltrados e estruturas foliculares contendo linfócitos CD3+ e CD20+, e plasmócitos CD138+ no TAM associado à DC em comparação aos controles. Conclusão: Nosso estudo revelou o acentuado acúmulo de linfócitos e plasmócitos que formam agregados disseminados, bem como folículos linfoides bem estruturados, no TAM associado ao íleo acometido pela DC, mas não nos controles. Notavelmente, os genes inflamatórios agudos altamente expressos na mucosa ileal na DC não estiveram acentuadamente expressos no TAM. Nossos dados apoiam fortemente o papel do TAM associado à DC como um local para a ativação células B, T e plasmócitos podendo atuar como um reservatório de resposta imune de memória e anticorpo-mediada. Para entender se essas respostas específicas a antígeno são prejudiciais ou protetoras na DC, serão necessários outros estudos
Abstract: Introduction: Crohn's disease (CD) is a multifactorial disease characterized by chronic intestinal inflammation. The increased visceral adiposity near the affected intestinal area, of which mesenteric adipose tissue (MAT) is the main component, is a feature of CD. Both protective, as well as pathological, roles have been attributed to this disease-associated tissue in CD. Aim: To understand the contribution of MAT to CD pathophysiology by providing a molecular and cellular signature of disease-associated adipose tissue in CD patients. Patients and Method: Whole transcriptional analysis was performed by RNA sequencing (RNA-seq) of MAT and ileum from CD patients with active disease (CD group, n=8) and non-IBD controls (CTR group, n=4). The biological validation of a panel of differentially expressed genes was conducted by real time polymerase chain reaction (qPCR) in 26 CD patients and 17 non-IBD controls. Immunohistochemistry and immunofluorescence were also performed for validation analysis. Results: RNA-seq identified 17 significantly regulated genes (|FC|>1.5; FDR<0.05) in CD-MAT compared to non-IBD controls, with a marked upregulation of plasma cell genes (i.e., IGLL5, MZB1, CD79A, POU2AF1, FCRL5, JCHAIN, DERL3, SDC1, PIM2). A less strict statistical cutoff value (|FC|>1.5, nominal p?0.05) revealed a larger list of 651 genes in CD-MAT compared to controls. Ingenuity Pathway Analysis of this signature revealed a significant regulation of pathways related to T- and B-cell functionality. In contrast to MAT, transcriptional analysis of the ileum revealed a set of 849 genes significantly regulated in CD compared to non-IBD controls (|FC|>1.5; FDR<0.05), and 2,654 genes when applying the lower cutoff (nominal p value<0.05). Despite the differences between the MAT and ileal signatures of CD patients, we identified a subset of 204 genes significantly modulated in both tissues. This common signature included genes related to the plasma cell signature (MZB1, POU2AF1, IGLL5, JCHAIN, DERL3 and PIM2) that were significantly up-regulated both in CD-MAT and ileum. In contrast, other genes that are highly increased in CD ileum such as S100A8 / S100A9 (calprotectin), IL1B, CD14, CXCL1, CXCL8, MMP1, OSMR, all of which are related to an acute inflammatory response, were exclusively regulated in the ileal mucosa of CD, but not in the adjacent MAT. In contrast, some genes encoding for lymphocyte receptors were exclusively regulated in CD-MAT, (i.e., MS4A1, CD6, CTLA4, CD3D, CD3E, IL2RG, LAG3-2, CD24, CD79A, CD5 and CD69), showing a different pattern of immune cell activation in this tissue compared to the ileum. qPCR in a patient and control cohort confirmed the significant upregulation of CD79A, SM4A1 (CD20), CTLA4 and CD3D in CD-MAT compared to controls, with no significant differences in IL1B and S100A8. Finally, immunohistochemistry and immunofluorescence analysis confirmed the large infiltrates and localized follicular structures containing CD3+ and CD20+ lymphocytes and CD138+ plasma cells in CD-MAT compared to the controls. Conclusions: Our study reveals the marked accumulation of lymphocytes and plasma cells that form disseminated aggregates, as well as well-structured lymphoid follicles, in the MAT associated with CD inflamed ileum, but not in controls. Remarkably, acute inflammatory genes highly expressed in the ileum were not markedly upregulated in the adipose tissue. Our data strongly supports the role of CD-associated MAT as a site for T-, B- and plasma cell activation and suggests that it could also act as a reservoir of memory immune and antibody-mediated responses. To understand if these specific responses to antigens are harmful or protective in CD, further studies are necessary
Doutorado
Fisiopatologia Cirúrgica
Doutora em Ciências
CAPES
001
FAPESP
2016/01638-7
