Author(s): Castro, Pedro Miguel Soares
Date: 2017
Persistent ID: http://hdl.handle.net/1822/45767
Origin: RepositóriUM - Universidade do Minho
Project/scholarship: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/SFRH/SFRH%2FBD%2F76894%2F2011/PT; info:eu-repo/grantAgreement/FCT/5876-PPCDTI/104980/PT ; info:eu-repo/grantAgreement/FCT/5876/147364/PT;
Subject(s): Ciências Naturais::Ciências Biológicas
Tese de Doutoramento em Biologia Molecular e Ambiental (Especialização em Biotecnologia Molecular)
Several monoterpenes (e.g. β-myrcene) have a great industrial potential due to their organoleptic and therapeutic properties. However, monoterpene exploitation as industrially-relevant molecules is often limited because of their intricate properties (e.g. high hydrophobicity and structural instability). Biocatalysis may overcome such drawbacks, resorting to specialized enzymatic machinery. Therefore, it is not surprising that microbial communities have been prospected for monoterpene-catabolizing strains, to efficiently transform these oily compounds. Pseudomonas sp. M1, isolated in 1999 from sediments of the Rhine river (Netherlands), was known to use the monoterpenes β-myrcene and β-citronellol as sole carbon sources, thus, harboring great potential as a cellular chassis and source of novel biomolecules. However, the full exploitation of M1 enzymatic repertoire required detailed information on its molecular catalogue. This PhD thesis aimed at the characterization of the β-myrcene-related molecular repertoire of Pseudomonas sp. M1, using a holistic experimental approach. Ultimately, this work envisaged to set the knowledge-base for the development of M1-based cell factories à la carte, towards the biotransformation of β-myrcene and related plant-derived volatiles. The genome of M1 strain was sequenced by different high-throughput sequencing platforms and reconstructed using a customized pipeline to achieve a robust genome draft. The resulting 7 Mb assembled genome (comprised in a single scaffold) was the foundation for following functional genomics approaches, aiming the characterization of the full set of β-myrcene-related genes. A RNA-seq using β-myrcene-grown M1 cells allowed the assessment of the β-myrcene stimulon and suggested an extensive molecular reprogramming, involving mechanisms of cell adaption to β-myrcene hydrophobicity and catabolism. Significantly, genes evidencing the highest β-myrcene-dependent expression level were located in a novel 28-kb genomic island (GI). In general, the genes included in the 28-kb GI shared low homology levels with sequences available in public databases. In silico analysis suggested that the 28-kb GI seems to be organized in 8 transcriptional units (TU), whose products are putatively involved in i) β-myrcene sensing, ii) β-myrcene oxidation and bioconversion of β-myrcene derivatives into the central metabolism intermediates, and iii) regulation of gene expression. Experimental validation of in silico predictions for the 28-kb GI was achieved by: i) constructing knock-out variants of the M1; ii) fusing the predicted promoter regions with reporter genes (gfp and lacZ); iii) evaluating β-myrcene-dependent promoter activity in the different genetic backgrounds (M1 and derived strains). Notably, a novel β-myrcene hydroxylase, responsible for the first oxidation of the β-myrcene backbone, was identified, as well as an essential sensor-like regulatory protein, whose inactivation abolished the ability of M1 cells to grow in β-myrcene. Moreover, the TUs present in the 28-kb GI were also differentially induced by other monoterpenes (e.g. linalyl acetate, limonene and β-pinene). Thus, the enzymatic repertoire of M1, showed a broader catabolic spectrum towards acyclic and cyclic monoterpene-backbones, extending the potential of M1-based catalysts. GC-MS identification of the metabolites produced by M1 and derived strains during β-myrcene biotransformation supported the performed genetic characterization and provided new hints on the versatility of M1 enzymatic machinery. Remarkably, the different M1 genotypes yielded different metabolite catalogues, which included several compounds with potential organoleptic/therapeutic properties (e.g. myrcen-8-ol, 4-methyl-3-hexenoic acid, carvone). The apparent uniqueness of the β-myrcene-associated genetic code prompted a bioprospection of the myr+ trait in the environment, to understand its evolutionary track. Soil samples, collected from 2 pristine locations in Peneda-Gerês National Park (Portugal), were enriched with different carbon sources (glucose, pyruvate or β-myrcene) and the evolution of the microbial communities monitored by 16S rRNA-based metagenomics. Exposure of the two microbiomes to β-myrcene led to a similar bacterial profile, mainly enriched in monoterpenedegraders species, some of which also reported elsewhere (e.g. Pseudomonas citronellolis and Rhodococcus erythropolis). Forty-one β-myrcene-catabolizing strains were isolated, from which ten (2 Achromobacter, 1 Cupriavidus, 1 Delftia, 4 Pseudomonas, 1 Sphingobacterium and 1 Variovorax strains) were selected for whole-genome sequencing and compared to M1 strain. A clear genetic code associated with β-myrcene catabolism was not identified in the non-Pseudomonas isolates, suggesting the existence of alternative β-myrcene catabolic pathways in those isolates, to be exploited as source of novel catalysts. Strikingly, the 4 Pseudomonas isolates (2 related to M1 strain and 2 related to P. protegens) harbored the full 28-kb GI, even though they were isolated from distinct geographic locations, almost 20 years apart with respect to M1. Comparative genomics showed that the 28-kb GI is, included in a 78-kb integrative element (ICE-like), inserted downstream a guaA gene and fully conserved in M1 and the 4 soil Pseudomonas isolates. Therefore, this 78-kb ICE appears to be the vehicle for the environmental dissemination of the β-myrcene trait, at least, among Pseudomonas. This work was the first holistic characterization of the β-myrcene catabolic pathway in a bacterial strain, providing an unprecedented biological knowledge that will be the cornerstone for following metabolic engineering strategy with synthetic biology platforms. Moreover, understanding the stability of the self-transmissible 78-kb catabolic ICE and its overall regulatory mechanisms, as well as its host range will provide insights about its evolutionary track and improve engineering strategies to optimize the performance of M1-based chassis.
Alguns monoterpenos (ex: β-mirceno), apresentam um grande potencial como precursores industriais devido às suas propriedades organolépticas e medicinais. Contudo, as suas características físico-químicas (alta hidrofobicidade e instabilidade estrutural) dificultam a sua transformação em produtos comercialmente relevantes. A biocatálise apresenta-se como uma estratégia aliciante através da utilização de sistemas enzimáticos especializados. Como tal, tem sido frequente, a bioprospecção de microrganismos capazes de catabolizar monoterpenos, para explorar o seu repertório enzimático em processos biotecnológicos. Em 1999, a estirpe Pseudomonas sp. M1 foi isolada de sedimentos do rio Reno (Holanda), sendo capaz de mineralizar β-mirceno e β-citronelol como fontes únicas de carbono. Deste modo, a estirpe M1 apresenta potencial para ser um chassi biológico e uma fonte de novas moléculas com relevância biotecnológica. No entanto, o estudo e exploração da sua maquinaria enzimática requerem um conhecimento detalhado sobre o seu catálogo de genes e proteínas. Este projecto de doutoramento teve como finalidade a caracterização da estirpe Pseudomonas sp. M1 através de abordagens de biologia de sistemas, permitindo integrar conhecimento dos seus mecanismos moleculares e fisiologia, para desenvolver fábricas celulares especializadas na biotransformação de monoterpenos, em especial, de β-mirceno. O genoma da estirpe M1 foi sequenciado por tecnologias de alto débito e reconstruido utilizando diversas ferramentas bioinformáticas, num único scaffold genómico com cerca de 7 Mb, que serviu de base para as abordagens seguintes de caracterização funcional. O transcriptoma de células da estirpe M1, crescidas na presença de β-mirceno foi analisado por RNA-seq, com a finalidade de descrever os genes envolvidos no catabolismo do β-mirceno. Esta abordagem sugeriu uma extensa reprogramação metabólica da estirpe M1, envolvendo mecanismos de adaptação à hidrofobicidade do β-mirceno e do seu catabolismo. Em particular, os genes que registaram maiores níveis de expressão foram localizados numa nova ilha genómica (GI) de 28-kb. A GI aparenta estar organizada em 8 unidade transcricionais (UT), putativamente envolvidas i) na deteção do β- mirceno, ii) na sua biotransformação, e iii) na regulação da via catabólica. A análise in silico da GI foi validada experimentalmente pelo i) knock-out de alguns dos seus genes e ii) fusão das suas regiões promotoras com os genes repórter gfp e lacZ, avaliando a atividade promotora β-mirceno-dependente associada às 8 UTs na estirpe M1 e mutantes construídos. Em particular, uma nova hidroxilase, responsável pela oxidação inicial β-mirceno, foi identificada, assim como uma nova proteína reguladora essencial para a activação de toda a GI e capacidade da estirpe M1 catabolizar β-mirceno. As UTs da GI foram também diferencialmente induzidas por outros monoterpenos (ex. linalool, limoneno e β-pineno), estendendo assim o potencial catabólico da GI para um largo espectro de monoterpenos de estrutura acíclica e cíclica. A identificação dos metabolitos produzidos durante a biotransformação do β-mirceno na estirpe M1e nos 4 mutantes, usando GC-MS, validou a caracterização genética da GI, assim como a versatilidade metabólica da estirpe M1 na produção de diversos compostos com possíveis propriedades organolépticas/terapêuticas (ex: mircenol, ácido 4-metil-3-hexenoico e carvona). O carácter único do código genético do catabolismo do β-mirceno motivou a sua prospecção no ambiente, para compreender a sua evolução. Amostras de solo de 2 locais distintos no Parque Nacional da Peneda-Gerês (Portugal) foram cultivadas em laboratório com diferentes fontes de carbono (glucose, piruvato ou β-mirceno), e a respetiva evolução bacteriana monitorizada por metagenómica direcionada ao gene 16S rRNA. Na presença de β-mirceno, os microbiomas de ambos os solos evoluíram para um perfil semelhante, sendo constituído maioritariamente por estirpes catabolizadoras de monoterpenos, algumas das quais já conhecidas (ex: P. citronellolis e R. erythropolis). Foram isoladas quarenta e uma bactérias catabolizadoras de β-mirceno, das quais 10 bactérias, pertencentes aos géneros Achromobacter (2), Cupriavidus (1), Delftia (1), Pseudomonas (4), Sphingobacterium (1) e Variovorax (1), foram sequenciadas e seu genoma comparado com o da estirpe M1. O genoma de Achromobacter, Cupriavidus, Delftia, Sphingobacterium e Variovorax não apresentou homólogos significativos à GI da estirpe M1, pelo que a identificação do seu código catabólico para β-mirceno requererá abordagens funcionais. Pelo contrário, o genoma das 4 estirpes de Pseudomonas (2 semelhantes à estirpe M1 e 2 semelhantes a estirpes de P. protegens) inclui a GI associada ao catabolismo do β-mirceno na estirpe M1. A comparação detalhada destes genomas com o genoma de M1 sugeriu que, efetivamente, a GI se encontra incluída num segmento altamente conservado de 78-kb, que se assemelha a um elemento integrativo (ICE), inserido a jusante do gene guaA nos 5 genomas. A conservação do ICE nas 5 estirpes sugere que este elemento integrativo deverá ser o vetor de transmissão do código genético para o catabolismo de β-mirceno, pelo menos em Pseudomonas. O trabalho apresentado nesta tese é a primeira descrição holística do catabolismo de β-mirceno em bactérias, disponibilizando informação biológica e conhecimento essencial, que servirá de base para planear futuras estratégias de engenharia metabólica, usando ferramentas de biologia sintética. O trabalho desenvolvido forneceu também pistas sobre i) a evolução do código genético para o catabolismo de β-mirceno da estirpe M1, cuja compreensão relativamente à sua estabilidade e regulação poderá fornecer pistas importante para a sua otimização, e sobre ii) a existência de vias catabólicas alternativas, que deverão certamente conter novas enzimas, abrindo novas possibilidades de transformar o β-mirceno numa gama de diferentes compostos.
This work was mainly funded by Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), Portugal through the PhD grant SFRH/BD/76894/2011 and projects PTDC/EBB-BIO/104980/2008. The work was also supported by by the strategic programme UID/BIA/04050/2013 (POCI-01-0145-FEDER-007569) funded by national funds through the FCT I.P. and by the ERDF through the COMPETE2020 - Programa Operacional Competitividade e Internacionalização (POCI), through the Centre of Molecular and Environmental Biology (University of Minho), in which the majority of the experimental activities were carried out.
