First molecular and biochemical characterization of the extracellular matrix of Saccharomyces cerevisiae

• Autor(es): Oliveira, Fábio Luís Silva Faria
• Data: 2013
• Identificador Persistente: https://hdl.handle.net/1822/27206
• Origem: RepositóriUM - Universidade do Minho
• Tipo de Documento: Tese de doutoramento
• Idioma: Inglês
• Contribuidor(es): Universidade do Minho; Lucas, Cândida; Ferreira, Célia

Descrição

A levedura Saccharomyces cerevisiae, tal como todos os microrganismos, é usualmente considerada como um organismo unicelular. Contudo, os microrganismos formam mais frequentemente comunidades multicelulares macroscópicas que apresentam diferenciação celular, e são coordenadas por um complexo sistema de comunicação, e suportadas por uma matriz extracelular (MEC). A presença deste tipo de suporte das comunidades multicelulares de S. cerevisiae foi descrita no início deste século. Apesar disso, a informação relacionada com a sua composição e organização tridimensional é escassa. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi realizar a primeira abordagem sistemática aos principais componentes da MEC de levedura. Para o efeito, foram desenvolvidas metodologias para (1) obter de forma reprodutível uma considerável e homogénea biomassa de leveduras produtora de MEC, e (2) extrair e fracionar a MEC produzida de forma a obter frações analiticamente puras de proteínas e polissacáridos, compatíveis com a aplicação de metodologias analíticas de alto-débito como o GC-MS e o DIGE. A análise detalhada da fração proteica permitiu a identificação de mais de 600 proteínas. A maioria destas tem função e localização intracelulares, e é aqui identificada extracelularmente pela primeira vez, o que pode indicar um moonlighting surpreendentemente elevado. A presença de todas as enzimas associadas à glicólise e à fermentação, assim como ao ciclo do glioxilato, levanta suspeitas sobre a possibilidade de haver metabolismo extracelular. Além disso, um grande número de proteínas associadas à síntese, remodelação e degradação de outras proteínas foi identificado, incluindo elementos da família HSP70 e várias proteases. De realçar a presença das exopeptidases Lap4, Dug1 e Ecm14, e das metaloproteinases Prd1, Ape2 e Zps1, que partilham um domínio funcional zincin com as metaloproteinases da MEC de Eucariotas superiores. A presença adicional de proteínas intervenientes em várias vias de sinalização, como as Bmh1 e Bmh2, e da homing endonuclease Vde, que partilha o domínio Hedgehog/inteína com os morfogenos de Eucariotas superiores, sugere que a MEC de levedura poderá, tal como nesses organismos, mediar sinalização intercelular. As análises cromatográfica e eletroforética da fração glicosídica revelaram claramente a presença de dois polissacáridos. A análise por espectrometria de massa identificou glucose, manose e galactose na composição destes polissacáridos. Foram ainda observados indícios da presença de ácido urónico. A indução de metacromasia sugeriu que os polissacáridos detetados apresentam substituição química. A possibilidade desta corresponder a sulfatação foi testada através de um teste de atividade anticoagulante. Das diversas amostras de MEC de diferentes estirpes de levedura usadas, o duplo mutante gup1Δgup2Δ apresentou, ao contrário da estirpe Wt, razoável atividade anticoagulante indicadora da presença de grupos sulfato. Os efeitos da deleção do gene GUP1 na composição da MEC de levedura proporcionaram uma perspectiva mais detalhada da composição molecular e mecanismos a ela associados. Observaram-se alterações nas frações protéica e glicosídica. A deleção resultou na ausência de várias proteínas, associadas principalmente com o metabolismo de fontes de carbono, defesa e resgate da célula, bem como síntese, modificação e degradação de proteínas, e organização celular. Adicionalmente, a deleção deste gene também teve um grande impacto na composição glicosídica da matriz, levando ao desaparecimento do polissacárido de maior peso molecular detetado na estirpe Wt. Globalmente, os efeitos da deleção do GUP1 na MEC mostram que a estrutura desta é muito dinâmica e que se encontra sob controlo apertado das células que compõem o agregado multicelular. As funções sugeridas para as proteínas ortólogas das Gup1 e Gup2 de levedura, respetivamente Hhatl e Hhat, nas vias de sinalização de Eucariotas superiores esteve na origem da construção de uma bateria de estirpes de levedura recombinantes transformadas com os ortólogos da via Hedgehog de ratinho, mosca e homem, para futura avaliação. Da mesma forma, foram clonados em S. cerevisiae os recetores de mamífero para o ácido hialurónico (AH), CD44 e HMMR. Estes transformantes foram submetidos ao crescimento na presença de AH de diferentes tamanhos moleculares. As estirpes exprimindo ambos os recetores foram igualmente sensíveis à presença de AH de elevado peso molecular, mas foram diferentemente sensíveis à presença de AH de tamanho molecular intermédio. As células expressando o recetor CD44 mostraram-se, tal como em Eucariotas superiores, sensíveis à presença de AH 50 kDa, apresentando uma forte redução da taxa específica de crescimento. Isto indica a expressão funcional dos recetores de AH em levedura e a provável conservação da maquinaria celular de resposta a este componente da MEC dos Eucariotas superiores. Este trabalho é o primeiro a apresentar um estudo detalhado sobre as frações protéica e glicosídica secretadas para a matriz extracelular de S. cerevisiae durante o seu crescimento em comunidades multicelulares, oferecendo a primeira abordagem proteómica e glicómica da sua composição e organização. Globalmente, este trabalho permite prever que a MEC de levedura exerça funções equivalentes às conhecidas da MEC de Eucariotas superiores.