Author(s): Martins, Daniel Filipe Marques Valente
Date: 2025
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10773/45298
Origin: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Subject(s): Microglia; MDMi; sTREM2; TREM2; DAP12; TYROBP; Nasu-Hakola disease; Alzheimer’s disease; Western blot
Nasu-Hakola disease (NHD) is a rare autosomal recessive disease caused by homozygous loss-of-function mutations in TYROBP or TREM2 genes, leading to bone cysts, early-onset dementia and premature death. Recently, heterozygous TYROBP deletion was identified as a novel risk factor for Alzheimer’s disease. TYROBP encodes DAP12, an adaptor protein that mediates intercellular signalling from cell surface receptor TREM2. DAP12 is expressed in the brain by microglia, highlighting the central role of microglia in neurodegeneration. This study aimed to validate the expression of microglial marker proteins (CX3CR1, PU.1 and P2RY12) in human monocyte-derived microglia-like cells (MDMi) and to optimize a Western blot protocol for investigation of TREM2-DAP12 signalling pathway. Optimization included testing of different sample amounts, antibody dilutions, and normalization methods. Additionally, soluble TREM2 (sTREM2) levels were quantified in human plasma to evaluate the effects of heterozygous/homozygous TYROBP deletion. We found that MDMi expressed all tested microglial markers and TREM2-DAP12 pathway proteins. The optimized Western blot protocol allowed for accurate detection of target proteins, and normalization to total protein was found as usable alternative for housekeeping gene normalization. In addition, we detected lower sTREM2 levels in plasma of NHD patients with homozygous TYROBP deletion compared to control individuals. These findings support the use of MDMi to study TREM2-DAP12 signaling and suggest that TYROBP deletion impacts sTREM2 secretion and microglial function.
A doença de Nasu-Hakola (NHD) é uma doença rara autossómica recessiva causada por mutações homozigóticas de perda de função nos genes TYROBP ou TREM2, que conduzem a quistos ósseos, demência precoce e morte prematura. Recentemente, foi identificada a deteção heterozigótica do TYROBP como um novo fator de risco para a doença de Alzheimer. O TYROBP codifica o DAP12, uma proteína adaptadora que medeia a sinalização intercelular a partir do recetor de superfície celular TREM2. O DAP12 é expresso no cérebro pela microglia, salientando o papel central destas células na neurodegeneração. Este estudo teve como objetivo validar a expressão de marcadores de microglia (CX3CR1, PU.1 e P2RY12) em células semelhantes a microglia derivadas de monócitos humanos (MDMi) e otimizar um protocolo de Western blot para investigação da via de sinalização TREM2-DAP12. A otimização incluiu o teste de diferentes quantidades de amostra, diluições de anticorpos e métodos de normalização. Adicionalmente, foram quantificados os níveis de TREM2 solúvel (sTREM2) no plasma humano para avaliar os efeitos da deleção heterozigótica/homozigótica do TYROBP. Verificou-se que as MDMi expressam todos os marcadores microgliais e proteínas da via TREM2-DAP12 testadas. O protocolo otimizado de Western blot permitiu a deteção precisa das proteínas alvo, sendo a normalização pelo total de proteína uma alternativa válida à normalização por gene housekeeping. Além disso, detetámos níveis inferiores de sTREM2 no plasma de pacientes com NHD, com deteção homozigótica do TYROBP, em comparação com indivíduos controlo. Estes resultados apoiam o uso das MDMi para o estudo da sinalização TREM2-DAP12 e sugerem que a deteção do TYROBP afeta a secreção de sTREM2 e a função microglial.
