Author(s): Paula, Vanessa B.
Date: 2012
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10198/7905
Origin: Biblioteca Digital do IPB
Subject(s): Própolis; Análise polínica; Fenóis totais; Flavonoides totais; Atividade antioxidante; TLC; Atividade antimicrobiana; Compostos fenólicos
O própolis é uma substância resinosa, obtida pelas abelhas Apis mellifera, considerado como um produto “antibiótico natural” que desempenha um papel importante na defesa da colmeia, protegendo-a de microrganismos, fungos, bactérias e vírus. Este produto possui na sua composição uma grande variedade de compostos, salientando-se os compostos fenólicos, aos quais se atribuem forte poder antioxidante e atividade antimicrobiana. Neste trabalho usaram-se duas amostras de própolis de origem geográfica diferente: Bornes e Lousã. Estudou-se a composição polínica, os teores totais de compostos fenólicos e flavonoides, bem como, as propriedades antioxidantes na amostra de Bornes. Da análise do extrato de própolis por TLC (cromatografia em camada fina), efetuaram-se estudos da atividade antimicrobiana usando-se extratos de manchas removidas da placa de TLC, selecionadas por terem grande concentração de compostos (manchas mais escuras). Os extratos das manchas separadas na placa de TLC foram analisados por HPLC e MS. A amostra de Lousã foi analisada no seu conteúdo em teores de compostos fenólicos totais e flavonoides totais. A análise polínica da amostra de própolis de Bornes mostrou que nesta predominavam os pólens Erica sp. e Castanea sp. com valores de abundância de 41% e 32% , respetivamente. A análise do perfil químico de amostras de própolis de Bornes e Lousã baseou-se nos teores de compostos fenólicos totais e flavonoides totais. Os teores de compostos fenólicos totais foram determinados pelo método de Folin-Ciocalteu, utilizando como padrão o ácido gálico. Os resultados obtidos foram de 91,5 ± 0,7 mg/L e de 117 ± 2 mg/L para as amostras de Bornes e Lousã, respetivamente. O doseamento de flavonoides totais baseou-se no método espetrofotométrico usando o reagente cloreto de alumínio e como padrão, a quercetina. Os resultados obtidos foram de 23,4 ± 0,8 mg/L e de 32,9 ± 0,1 mg/L para as amostras de Bornes e Lousã, respetivamente. A atividade antioxidante foi avaliada pelo método do poder redutor e pelo efeito bloqueador de radicais livres de DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) para a amostra de própolis de Bornes. Para o método do poder redutor os resultados evidenciaram valores de EC50 de 0,33 ± 0,02 mg/mL, e para o método de DPPH demonstraram valores mais baixos de EC50, 0,072 ± 0,003 mg/mL. O extrato de própolis de Bornes foi analisado por TLC (sílica gel 60 com fluorescência a 254 nm) usando a técnica bidimensional com o objetivo de obter uma primeira separação de compostos para posteriormente serem identificados por HPLC-DAD e MS. A separação dos compostos fenólicos na placa de TLC foi visualizada usando reagentes ou radiação UV 254 nm. Os reagentes usados na visualização das manchas referentes aos compostos fenólicos separados na placa de TLC, foram: cloreto de alumínio, cloreto de ferro, Folin-Ciocalteu, DPPH e vanilina. Para analisar a atividade antimicrobiana selecionaram-se manchas de TLC com grande concentração de compostos (manchas mais escuras) provenientes do própolis de Bornes. A extração dos compostos da sílica gel da mancha selecionada foi efetuada usando-se o solvente dimetilsulfóxido (DMSO). Os compostos presentes nas manchas de TLC isoladas e testadas inibiram os microrganismos em estudo (Salmonella spp., Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus e Candida albicans). O método de HPLC com detetor DAD foi usado com o objetivo de analisar os extratos da sílica gel de todas as manchas identificadas na placa de TLC, de forma a identificar a que família de compostos fenólicos pertencem os picos obtidos em cada cromatograma. Nos cromatogramas de cada extrato verificou-se sempre a presença de vários picos mostrando que a separação por TLC não permite um isolamento total dos compostos. A identificação da família do composto fenólico de cada pico presente nos cromatogramas foi feita por comparação com padrões puros, e só nos casos de se ter uma “semelhança elevada” nos espetros UV é que se avançou com a identificação do grupo a que pertence o composto fenólico. Dos identificados, a família de compostos fenólicos mais abundante foi a dos ácidos hidroxicinâmicos. Neste trabalho faz-se uma breve apresentação de resultados preliminares obtidos com o método MS, com o objetivo de dar continuidade a este trabalho no futuro. Este método ainda está a ser estudado nas suas condições experimentais de forma a identificar todos os compostos fenólicos presentes nos extratos das manchas separadas na placa de TLC. Os primeiros resultados mostram que os compostos presentemente identificados são derivados do ácido cafeico e da pinobanksina. Propolis is a resinous substance obtained by honey bees Apis mellifera, a product considered "natural antibiotic" which plays an important role in defending the hive, protecting it from microorganisms, fungi, bacteria and viruses. This product has a large variety of compounds in its composition, giving greater emphasis to the phenolic compounds, which are attributed strong antioxidant and antimicrobial activities. This work used two propolis samples of different geographical origin: Bornes and Lousã. It was studied the pollen composition, the total content of flavonoids and phenolic compounds, as well as the antioxidant properties of the Bornes sample. Analysis with propolis extracts separated by TLC (Thin-Layer Chromatography), were made in studies of antimicrobial activity by using extracts of stains removed from the TLC plate, selected for having large concentration of compounds (darker stains). The extracts of stains separated on TLC plate were analyzed by HPLC and MS. The Lousã sample was analyzed in their content in phenolic compounds and total flavonoids. Pollen analysis of the Bornes propolis sample showed that the predominant pollens Erica sp. and Castanea sp. had abundance values of 41% and 32%, respectively. The analysis of the chemical profile of Bornes and Lousã propolis samples was based on the content of total phenolic compounds and flavonoids. The concentrations of total phenolics were determined by Folin-Ciocalteu, using gallic acid as standard. The results were 91,5 ± 0,7 mg/L and 117 ± 2 mg/L for the samples of Bornes and Lousã, respectively. The assay of total flavonoids was based on the spectrophotometric method using the reagent aluminum chloride and as standard compound, quercetin. The results were 23,4 ± 0,8 mg/L and 32,9 ± 0,1 mg/L for samples of Bornes and Lousã, respectively. The Bornes sample antioxidant activity was evaluated by the method of reducing power and the blocking effect of free radicals of DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) for the sample. The assay of reducing power showed EC50 values of 0,33 ± 0,02 mg/mL, and the DPPH assay showed lower values of EC50, 0,072 ± 0,003 mg/mL. The Bornes propolis extract was analyzed by TLC (silica gel 60 with fluorescence at 254 nm) using the two-dimensional technique in order to obtain an initial separation of compounds for later identification by HPLC-DAD and MS. The separation of the phenolic compounds in the TLC plate was visualized using UV irradiation at 254 nm or chemical reagents. The reagents used in the visualization of stains pertaining to phenolic compounds separated on TLC plate, were: aluminum chloride, iron chloride, Folin-Ciocalteu, DPPH and vanillin. To analyze the antimicrobial activity were selected TLC stains with high concentrations of compounds (darker stains) from the Bornes propolis two-dimensional TLC analysis. The compounds extraction from the selected silica gel stain was carried out using the solvent dimethylsulfoxide (DMSO). The extracted compounds of the TLC spots isolated and tested inhibited the growth of the microorganisms under study (Salmonella spp., Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus e Candida albicans). The HPLC method with DAD detector was used to analyze the extracts of silica gel of all stains identified on TLC plate in order to identify the family of phenolic compounds belonging to the peaks in each chromatogram obtained. In the chromatograms of each extract, it was verified the presence of several peaks showing that separation by TLC does not permit a total isolation of each compound. The identification of the phenolic compounds family in each peak in the chromatograms was done by comparison with pure standards. Only in cases of having a "high similarity" in the UV spectrum, it was possible to advance with the identification of the family to which compound phenolic belongs. Of the identified family of phenolic compounds, the most abundant was hydroxycinnamic acid. This work makes a brief presentation of preliminary results obtained with the MS method, being a component of this work that remains to be completed, in order to identify all phenolic compounds present in the extracts of stains separated on TLC plate. Initial results show that the compounds identified are presently caffeic acid derivatives and pinobanksina.
