Stem cell-based reporter assays for the identification of carcinogenic properties of (non)-genotoxic chemicals

• Author(s): Gonçalves, Cátia Sofia Alão, 1988-
• Date: 2013
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/10307
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Biomarcadores; Carcinogenos; Toxicidade; Teses de mestrado - 2013
• Document Type: Master thesis
• Language: English
• Advisor(s): Vrieling, Harry; Dias, Deodália Maria Antunes, 1952-
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013

Nos dias que correm, existem a geração contínua de novos produtos químicos, quer seja para o desenvolvimento de drogas, quer para aplicação na indústria alimentar, cosmética ou mesmo na agricultura. Portanto, antes que um composto possa ser colocado à venda no mercado, é necessário realizar vários testes, para que se possa excluir aquelas propriedades nocivas para a saúde humana, incluindo o potencial risco de cancro. No entanto devido ao crescente número de novos produtos químicos, existe a forte necessidade de encontrar ensaios in vitro que sejam rápidos em fornecer os resultados, baratos, relativamente fáceis de aplicar e ainda que apresentem uma taxa alta de sensibilidade de fiabilidade para avaliação do risco de cancro para o Homem. O DNA é uma molécula complexa, que necessita de alguma integridade, para tal esta tem de ser protegida dos agentes ambientais, tais como a luz UV, produtos químicos provenientes de alimentos, medicamentos, ou mesmo gerada espontaneamente durante o metabolismo do DNA. Por esta razão, os organismos foram capazes de desenvolver vários mecanismos de defesa celular, incluindo as vias de reparação do DNA, os “checkpoint” do ciclo celular ou a indução da apoptose, de modo a proteger contra os efeitos tóxicos, mutagénicos de um possível exposição. As propriedades carcinogénicas dos químicos são frequentemente associados com o seu potencial genotóxico, ou seja, a capacidade de provocar lesões no DNA. Como resultado, estes químicos podem modificar a estrutura do DNA, levar à formação de ligações cruzadas, ductos, quebras simples e duplas da cadeia de DNA, bloquear a progressão do garfo de replicação ou os mecanismos de transcrição de um gene. A interferência da replicação do DNA ou da transcrição de um genes pode levar a mutações e rearranjos cromossómicos e, por vezes, pode levar a um evento oncogénico. Muitos dos químicos carcinogénicos são capazes de levar a lesões do DNA e são “genotóxicos” no seu modo de acção. Existem, no entanto, um grupo de compostos carcinogénicos que induzem cancro na forma não-genotóxicos, ou seja, sem levar a alterações do DNA, quer seja a nível do número de cromossoma quer seja a nível da estrutura. O modo pelo qual os químicos carcinogénicos não-genotóxicos exercem a sua acção pode incluir os supressores imunológicos, proliferados de peroxissomas, agonistas dos receptores de hormonas, inibidores da fosfatase e os metalóides. No entanto, ao contrário dos compostos carcinogéneos genotóxicos, o mecanismo pelo qual os carcinogénicos não-genotóxicos levam à carcinogénese ainda é desconhecido. Como tal, actualmente não existem ensaios in vitro disponíveis para estabelecer as propriedades potencialmente carcinogéneas dos compostos cancerígenos não-genotóxicos. Usualmente, para detectar agentes cancerígenos não-genotóxicos recorresse a estratégias que utilizam ensaios baseados em parâmetros genotóxicos. O teste de Ames é um teste bacteriano que utiliza a mutagenicidade como parâmetros genotóxicos, mas pode-se também recorrer a genotoxicidade em células de mamíferos. No entanto, estes compostos não são detectados por estes ensaios, e acabam por passar despercebido. Logo, o ensaio mais utilizado para este caso de compostos químicos é recorrer a bioensaios para detectar a carcinogenicidade, usando roedores. Logo, face ao aumento do número de composto e com vista à diminuição de bioensaios, realizámos este projecto que tinha como objectivo descrever a geração de um novo repórter baseado na utilização de GFP que permitia detectar as possíveis propriedades de compostos cancerígenos não-genotóxicos, que era específico para a resposta a proteínas mal enoveladas (UPR, do inglês: Unfolded Protein Response) Para que se pudesse desenvolver estes repórteres baseados em GFP, realizámos um “genome-wide transcription profiling” utilizando mES que foram previamente expostas a diversos agentes cancerígenos não-genotóxicos. Após análise dos “genome-wide transcription profiling”, foi possível seleccionar quatro genes biomarcadores, Armet, Derl3, Dnajc3 e Ddit3, que eram induzidos após exposição a supressores imunológicos e a metalóides. Recorrendo ao qRT-PCR confirmámos esta indução, e verificámos que os genes biomarcadores Armet, Derl3 e Dnajc3 eram induzidos após exposição com o supressor imunológico cisclosporina A, e o gene biomarcador Ddit3 era induzido após exposição ao metalóide arsenito de sódio. Para que os genes biomarcadores que seleccionámos pudessem ser utilizados como repórteres baseados em GFP, recorremos à técnica de recombinação de cromossoma artificial bacteriano (BAC, do inglês: bacterial artificial chromosome). Esta técnica consiste em gerar linhas celulares que expressam uma proteína de fusão de GFP e, portanto, é possível determinar facilmente indução do gene pela quantidade de fluorescência emitida pela proteína de fusão de GFP modificada após o tratamento com um determinado composto. Uma vez que os genes biomarcadores, Armet-GFP, Derl3-GFP, Dnajc3-GFP e Ddit3-GFP, se encontraram funcionais, estes foram expostos a cancerígenos não-genotóxicos, que incluía a: cisclosporina A; o arsenito de sódio; e a tunicamicina, e a carcinogéneos genotóxicos, nomeadamente a cisplatina, a doxorrubicina e a peróxido de hidrogénio. Após análise da citometria de fluxo, verificámos que os nossos genes biomarcadores não eram induzidos por químicos carcinogéneos genotóxicos, mas que por sua vez eram fortemente induzidos quer por a cisclosporina A e arsenito de sódio, mas também por tunicamicina, que nos levou a afirmar que estes biomarcadores eram específicos para o UPR e que o supressor imunológico cisclosporina A e o ao metalóide arsenito de sódio estão envolvidos no UPR. Uma vez desenvolvidos os repórteres GFP, o próximo passo era testar a especificidade e sensibilidade. Para tal, validámos, juntamente com os genes biomarcadores para os compostos cancerígenos não-genotóxicos, uns repórteres GFP desenvolvidos anteriormente para os compostos carcinogéneos genotóxicos. Os repórteres GFP foram expostos a 53 químicos propostos pela ECVAM, que inclui compostos carcinogéneos genotóxicos, cancerígenos não-genotóxicos e compostos não-carcinogénicos. Após análise dos dados, observámos que tínhamos desenvolvido repórteres GFP com diferentes sensibilidades, uns eram capazes de detectar compostos carcinogéneos genotóxicos que induziam lesões genotóxicas ou stress oxidativo, e outros que eram capazes de detectar compostos cancerígenos não-genotóxicos que detectavam compostos que induziam lesões nas proteínas. Para que pudéssemos correlacionar a activação dos repórteres GFP com um fim biológico, decidimos recorrer a um ensaio in vitro vulgarmente utilizado para detectar genotoxicidade. Recorremos à utilização do ensaio do cometa, visto este ser um ensaio que é amplamente utilizado para avaliar lesões no DNA. No entanto, este ensaio ainda não tinha sido descrito para as mES. Começamos por optimizar o ensaio do cometa e concluímos que este não tinha a capacidade de detectar compostos cancerígenos não-genotóxicos, e para além de que mesmo tendo a capacidade de detectar compostos carcinogéneos genotóxicos, não eram informativo sobre o tipo de lesão que induzia, quer fosse lesões no DNA ou dano oxidativo. Em suma, podemos concluir que ao usar a combinação de diferentes linhagens celulares de repórteres baseados em GFP, somos capazes de discriminar entre compostos que induzem principalmente lesões genotóxicas, stress oxidativo ou lesões nas proteínas Com este estudo fomos ainda capazes de demonstrar que o ensaio do cometa, um ensaio tradicionalmente utilizado in vitro para detectar propriedades genotóxicos de compostos, não tem a mesma sensibilidade e especificidade que os repórteres GFP que desenvolvemos, na medida em que o ensaio do cometa não permitiu detectar compostos carcinogéneos não-genotóxicos e não forneceu qualquer informação sobre o tipo de lesão causada pelos compostos carcinogéneos genotóxicos. Com este estudo, podemos afirmar que desenvolvemos um ensaio in vitro, que é altamente sensível e específico, que pode fornecer informações sobre a toxicidade relativa de produtos químicos, e que ao mesmo tempo é rápido e tem elevada fiabilidade para avaliação do risco de cancro para o Homem e que permite de certa forma levar a redução de biosensaios.

There is a continuous generation of new chemicals for drug development or applications in food industry, cosmetics and agriculture. Before compounds are allowed on the market, they first require testing to exclude hazardous properties on human health, including potential cancer risk. Due to the increasing number of new chemicals there is a strong demand for rapid, easy to use high-throughput in vitro assays for human cancer risk assessment. The induction of cancer is strongly associated with DNA damage and mutations upon exposure to genotoxic compounds. However, there are many non-genotoxic (NGTX) compounds that have been shown to be carcinogenic. The mechanisms by which these non-genotoxic carcinogens (NGTXC) induce cancer is often unclear. Here we describe the development of four different mES reporter cell lines for the detection of possible carcinogenic properties of non-genotoxic chemicals. The GFP-based reporter cell lines are based on the activation of biomarker genes that are predictive for exposure to specific NGTXC. By genome transcription profiling of mES and qRT-PCR we identified genes that were transcriptionally activated upon exposure to NGTXC. Four genes (Armet, Dnajc3, Derl3 and Ddit3) were induced by the immune suppressors CsA and Fk506 and by the metalloid NaAsO2. These genes were generated by BAC recombineering, were GFP-reporters genes were stably integrated in mES cells. These biomarker genes have previously been associated with the induction of the unfolded protein response (UPR), suggesting the UPR is a mode of action of CsA and NaAsO2. These GFP-reporters cell lines are specifically activated upon exposure to compounds that induce protein damage. A panel of different mES reporter cell lines will allow identification of the potential carcinogenic properties of non-genotoxic chemicals and in addition can detect protein damage.