Author(s): Nunes, João Pedro da Costa
Date: 2013
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/10697
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Leishmasiose; Leishmania infanfum; Óxido nítrico; S-nitrosilação; Método de "Biotin-Switch"; Nitrosoproteoma; Teses de mestrado - 2013
Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013
O parasita Leishmania infantum, endémico nos países mediterrânicos, incluindo Portugal, é o causador da leishmaniose visceral, uma doença letal se não for tratada e para a qual não existem vacinas humanas. Tendo um ciclo de vida complexo, estes parasitas regulam a expressão e a função de proteínas através de modificações pós-traducionais (PTMs), extremamente importantes no seu desenvolvimento e infecção, nomeadamente a S-nitrosilação. Este trabalho teve dois objectivos principais. O primeiro foi a identificação do nitrosoproteoma da Leishmania infantum. Este objectivo foi conseguido utilizando duas abordagens proteómicas: a identificação por peptide mass fingerprint (PMF) por MALDI-FT-ICR e a análise por cromatografia líquida nano e espectrometria de massa (nanoLC-MS). O segundo objectivo foi a identificação dos processos metabólicos em que a nitrosilação pelo óxido nítrico poderá estar envolvida, de forma a perceber qual a importância desta modificação pós-traducional em L. infantum. No total foram identificadas 137 proteínas diferentes, 8 por MALDI-FT-ICR e 134 por nanoLC-MS. De salientar que apenas 3 proteínas identificadas por MALDI-FT-ICR não foram identificadas através de nanoLC-MS. De entre os vários processos celulares identificados, que contêm proteínas nitrosiladas, podemos destacar como mais relevantes os processos de folding proteíco, a resposta ao stress e o metabolismo dos glúcidos. No que diz respeito ao folding proteico, a S-nitrosilação das proteínas de choque térmico Hsp70 e Hsp83, bem como da proteína dissulfito isomerase, poderá modelar a sua função como chaperone. Em relação à resposta ao stress, é interessante a S-nitrosilação do triparedoxina peroxidase e do glioxalase I, enzimas envolvidos no stress oxidativo e carbonílico, respectivamente. A modificação destes enzimas pelo NO poderá inibir a sua actividade enzimática. Por fim, em relação ao metabolismo de glúcidos, a S-nitrosilação do GAPDH poderá exercer um papel fundamental no controlo do fluxo glicolítico o enolase poderá ter um papel importante no scavange do NO produzido pelo hospedeiro na fase de amastigota.
The parasite Leishmania infantum, endemic from the Mediterranean region, including Portugal, it’s the leading cause of visceral leishmaniasis, a lethal condition if untreated and for which there are no human vaccines. Due to their complex life cycle, these parasites use posttranslational modifications (PTM), e.i. S-nitrosylation, to regulate the expression and function of proteins being these extremely important in the parasite’s development and infection capacity. One of the two main objectives of this project was the Leishmania infantum nitrosoproteome identification. This objective was accomplished using two proteomic approaches: identification by peptide mass fingerprint (PMF) through MALDI-FTICR and analysis through nanoscale liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (nanoLC-MS). The second objective was the identification of the metabolic processes in which nitric oxide nitrosylation might be involved to allow us to understand more about the importance of this posttranslational modification in L. infantum. Totally we identified 137 different proteins, 8 through MALDI-FT-ICR and 134 through nanoLC-MS. Among the celular processes identified as containing nitrosilated proteins, protein folding, stress response and carbohydrate metabolism are the most important ones. S-nitrosilation of heat shock proteins Hsp70 and Hsp83, as well as of disulfide isomerase may modelate chaperon function. Besides of that, it´s interesting that S-nitrosilation of Tryparedoxin peroxidase and glyoxalase I, enzymes involved in oxidative and carbonylic stress, respectively, may inhibit theirs enzymatic activity. Lastly, the S-nitrosilation of GAPDH may be relevant in glycolytic flux control and enolase may be important in the scavange of NO.
