Exploring new therapeutic approaches for Hypertrophic cardiomyopathy

• Author(s): Santos, Catarina Pereira, 1991-
• Date: 2014
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/15558
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Cardiopatias; Cardiomiopatia hipertrófica; Terapia genética; Teses de mestrado - 2014
• Document Type: Master thesis
• Language: English
• Advisor(s): Crespo, Ana Maria Viegas, 1946-; Martins, Sandra
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014

Dentro das doenças cardíacas hereditárias, a Cardiomiopatia Hipertrófica é uma das mais frequentes, sendo causa de morte súbita em atletas e jovens adultos. Esta patologia resulta de mutações em genes que codificam proteínas do sarcómero, unidade funcional das células cardíacas. Actualmente, estão identificadas mais de 900 mutações associadas a 13 genes distintos, entre os quais o gene TNNT2 (Troponin τ) No entanto, até à data, não existe tratamento que permita corrigir com eficácia as alterações das células cardíacas nos indivíduos afectados pela Cardiomiopatia Hipertrófica. Diversos estudos utilizando a terapia genética com vista ao tratamento de doenças hereditárias, observam que este é dos mais complexos. Por um lado, as abordagens terapêuticas que envolvem a substituição por recombinação homóloga de um gene endógeno mutado por um gene terapêutico mostraram-se pouco eficientes. Por outro lado, a utilização de sistemas virais que promovam a eficiente integração de genes terapêuticos no genoma de células mutadas mostrou-se potencialmente desastrosa. Tal situação advém da aleatoriedade do local de integração, podendo resultar na activaçãojinactivação de genes endógenos não mutados, alterando o funcionamento normal da expressão génica das células-alvo tratadas. Na tentativa de ultrapassar estas dificuldades, novas abordagens terapêuticas têm emergido in vivo ou ex vivo. Nos protocolos in vivo, o objectivo é inserir o gene terapêutico dentro de um vector e administrar o vector terapêutico directamente no organismo. Na estratégia ex vivo, algumas células-alvo são retiradas do organismo, recebendo o gene terapêutico in vitro, sendo posteriormente devolvidas ao indivíduo as células corrigidas. Para além das questões já apresentadas, outro dos grandes desafios da terapia genética é a inserção do vector terapêutico dentro das células. Existem várias estratégias possíveis de serem utilizadas, podendo envolver métodos virais ou não-virais, no entanto, para cada doença é necessário planear uma estratégia criteriosa e cautelosa que melhor se aplique ao caso em estudo. Até à data, as tecnologias de edição de genoma mais utilizadas são as ?inc [inger !1ucleases (ZFNs) e as !ranscriptiona/ Ç!ctivator-[ike dfector I]ucleases (TAlENs). Estas técnicas utilizam proteínas com actividade de nuclease, constituídas por vários domínios de ligação ao DNA que, quando conjugados, reconhecem uma sequência genómica, clivando-a e induzindo quebras na dupla cadeia de DNA. Estas quebras activam os mecanismos celulares de reparação de DNA, permitindo desta forma a introdução de um gene terapêutico de interesse, por recombinação homóloga, nestas regiões genómicas. A recente descoberta do sistema procariótico CRISPR (çlustered regu/ar/y lnterspaeed ~hort ealindromie repeats) forneceu aos investigadores uma tecnologia de enorme potencial para a edição de genoma. A grande vantagem deste sistema prende-se com o facto de as endonucleases serem guiadas ao local a corrigir por um RNA complementar ao DNA alvo, tornando esta abordagem não só altamente específica e eficiente, como menos laboriosa que as metodologias antecedentes. Neste trabalho propõe-se desenvolver uma nova abordagem terapêutica para a Cardiomiopatia Hipertrófica, através da indução de quebras de cadeia dupla no gene TNNT2 numa região a montante de um conjunto de mutações associadas a esta doença, por forma a permitir a inserção de um DNA complementar (cDNA) terapêutico por fenómenos de recombinação homóloga. Desta forma, inicialmente foi caracterizada a isoforma de TNNT2 mais frequentemente expressa em cardiomiócitos HL-l, linhagem de células importante para posteriores ensaios. Com base nesses resultados, planificou-se a estratégia que seria usada na abordagem ao gene de ratinho TNNT2, recorrendo-se à utilização do sistema CRISPR/Cas9. Posteriormente, foram testadas a especificidade e eficiência de clivagem deste novo sistema para o /oeus específico do gene TNNT2, em duas linhagens celulares (cardiomiócitos HL-l e células embrionárias estaminais E14 tg2a) observando-se que Gl e G8 são as sequências-guia de RNA que apresentam os níveis de eficiência mais elevados. Para além disso, observou-se também que estas apresentam uma maior eficiência em células E14 tg2a do que em HL-l, devido aos mecanismos de reparação de células esta minais serem mais activos que em cardiomiócitos. De seguida, três plasmídeos diferentes, contendo a sequência terapêutica (cDNAEx10-18) e os dois braços de homologia (S'HA e 3'HA) necessários para facilitar a sua inserção, foram construídos para posterior co-transfecção com as sequências-guia de RNA (Gl e G8) nas linhagens celulares já referidas. Por fim, foi ainda realizado um estudo bioinformático sobre uma das principais limitações do sistema CRISPR/Cas9, os eventos off-target. Deste estudo conclui-se que entre as duas sequências-guia de RNA que apresentaram eficiência de clivagem, apenas a G8 poderá apresentar potenciais problemas. Uma vez demonstrada a eficiência desta nova metodologia a nível celular, a mesma poderá ser testada in vivo, num modelo animal de Cardiomiopatia Hipertrófica, com vista a uma eventual aplicação em doentes.

Hypertrophic Cardiomyopathy (HCM) is the most common hereditary heart disease and the main cause of sudden cardiac death (SCD) in young adults and athletes. There are currently 900 HCM-associated mutations identified in 13 different genes and troponin T gene (TNNT2) is one of them. Despite ali the knowledge regarding the genetic mutations associated with this disorder, up until now there is no effective treatment available for HCM patients. This research project aims the establishment of a proof-of-principle for a new gene therapy approach targeting HCM, in cardiomyocytes (HL-l) and embryonic stem cells (E14 tg2a). The strategy is to induce double-strand breaks (DSB) in an upstream region of murine TNNT2 gene containing a cluster of mutations associated with HCM. ln order to do this, we took advantage of a new genome-editing tool called CRISPR/Cas system (flustered regularly lnterspaced ~hort galindromic repeats /CRISPR-associated) that uses programmable RNA¬guided DNA endonucleases to create DSBs, thereby stimulating homologous recombination between the targeted chromosome and a therapeutic DNA template (cDNAExl0-18). It was observed that the CRISPR/Cas9 system could cleave the TNNT2 locus with high efficiency by Gl and G8 guide-RNAs (gRNA), in both cell lines. As expected, the cleavage efficiency of E14 tg2a cells was higher than in HL-l cells due to the active repair mechanisms characteristic of stem cells. Finally, it was also performed a bioinformatics analysis for the study of potential off-targets events induced by the gRNAs. Once the proof-of-principle at cellular levei is established, it is crucial to test this promising methodology in a mouse model of HCM, in planning for potential application to patients. The power of CRISPR/Cas9 system to perform targeted and highly efficient alterations of genome sequences will undoubtedly transform biological research and push the development of novel molecular therapeutics for human disease.