Author(s): Martins, Maria Solange Gonçalves Barbas Baptista, 1991-
Date: 2014
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/15758
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Manipulação genética; Sequenciação; Peste suína africana; Teses de mestrado - 2014
Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014
The I329L ORF of the African swine fever virus is a host evasion gene coding for a transmembrane protein inhibiting the induction of interferon through activation of Toll Like Receptor 3 (TLR3). Additionally, by sharing sequence similarities with TLR3, and also inhibiting TRIF mediated NF-kb activation, the protein has been characterized as a viral TLR3 antagonist. The key observation formed backing the project was that the I329L protein expressed in transfected cells not only yielded the predicted 50 kDa component, but also another one of 35 kDa. Thus the objective of this work was to explain the origin of the 35 kDa component. Two hypotheses were proposed to explain the origin of the 35 kDa molecule: (a) Translation of the I329L from a second AUG, predicted to yield a molecule of the expected size. (b) Proteolytic degradation of the 50 kDa full length protein, as indeed has been observed for other TLRs. Clear cut evidence for the first hypothesis was obtained as an I329L mutated at the second AUG only yielded a 50 kDa component in transfected cells. Importantly, both full length and second AUG 35 kDa constructs induced a similar inhibition of TLR3 signalling in luciferase reporter assays. Moreover, the full length and 35 kDa components were found to similarly localize to the endosome after activation of the TLR3 with double stranded RNA.
A peste suína africana (PSA) é uma doença hemorrágica letal, muito contagiosa que afecta os porcos domésticos, com implicações socio-ecónomicas, tendo em conta que sem uma vacina o único controlo da doença implica o sacrifício dos porcos afectados e quarentena dos animais da mesma exploração. O vírus causa uma infecção persistente e assintomática nos seus hospedeiros naturais, o porco-bravo, javalis e carraças. Já existe sinais de contaminação na Rússia e o risco da doença se espalhar pela europa depende da população animal selvagem e das quintas com pouca segurança biológica, mas também do comércio entre os países africanos e a Europa. Quando uma célula é infectada por um vírus, ela é capaz de reconhecer o microorganismo invasor ao reconhecer os padrões moleculares associados ao patogéneo (PMAP) graças aos seus receptores de reconhecimento de patogéneos (RRP), e por vários caminhos diferentes é capaz de induzir a expressão do interferão (IFN), uma citocina, de tipo I. A célula desenvolve um estado anti-viral e pelo impacto do IFN secretado, estabelece um estado anti-viral semelhante nas células vizinhas. Os receptores TLR fazem parte dos RRP e têm um papel importante na imunidade inata contra infecções, ao se ligarem a moléculas microbianas. As células infectadas por vírus dependem principalmente dos TLR3, TLR7/TLR8 e TLR9 para induzir a expressão do IFN do tipo I e assim detectar os ácidos nucleicos. Foi relatado que estes TLR, localizados em endossomas, são clivados por catepsinas sendo essencial para uma sinalização mais eficiente e maior estabilidade. Os vírus de ADN possuem vários mecanismos estratégicos/genes que modulam de forma positiva ou negativa a biologia celular do hospedeiro, bem como a resposta imunitária. Existem várias estratégias contra o sistema do IFN, que incluem a inibição da sua produção, a inibição das suas vias de sinalização, e bloqueio de enzimas induzidas pelo IFN com actividade antiviral. Neste caso, o Vírus da Peste suína africana (VPSA), desenvolveu vários genes de evasão às respostas imunes do hospedeiro, entre os quais a ORF I329L, que codifica uma proteína transmembranar do tipo I, contendo quatro zonas de repetição de leucinas no seu domínio extracelular e com homologia no domínio intracelular com as Box1 e Box2 do domínio TIR intracelular do TLR3. Recentemente, análises à proteína revelaram que inibe um componente da resposta inata, a indução do IFN de tipo I pela activação da via do TLR, isto é, a indução e secreção do IFN-β, bem como a activação do NF-kB. Essa inibição é adquirida por dois mecanismos distintos, nomeadamente pelo domínio extracelular que inibe a interacção do TLR com o ligando de RNA de dupla cadeia (dsRNA), e pelo domínio intracelular que causa um impacto na transdução do sinal pela associação com o intermediário TRIF. O I329L foi então caracterizado como um antagonista viral do TLR3, afectando de forma negativa a resposta antiviral do hospedeiro pela via do IFN tipo I. Por este motivo, seria uma abordagem racional eliminar o I329L do vírus para a construção de uma vacina viral atenuada e por isso é essencial compreender os mecanismos de acção deste gene. Como o TLR3, assim como o TLR7 e TLR9, precisam de ser proteoliticamente processados para uma melhor capacidade de sinalização, existe a possibilidade de que o I329L pode ser igualmente processado por um mecanismo semelhante. Ao estudar o I329L em células transfectadas, foi possível observar dois componentes proteicos, um com a massa molecular prevista de ~50 kDa, e outro de ~35 kDa. A origem do componente de menor massa molecular pode ter origem em um processamento da proteína de 50 kDa ou, alternativamente, ser o produto de uma tradução a partir do segundo codão AUG que codifica uma metionina, no dominio extracellular do I329L, o que levaria à produção de uma proteína do tamanho esperadode 35 kDa. Deste modo, os principais objectivos da tese foram determinar se o I329L sintetizado a partir do segundo AUG inibe a activação do TLR3, e se existe processamento proteolítico após activação com RNA de dupla cadeia, isto é poly (I:C). Para responder a estas questões, foi primeiro necessário clonar o I329L com uma “immunotag” Myc no N terminal e uma “immunotag” HA no C terminal. A seguir, de modo a responder à questão colocada pelo primeiro objectivo, o I329L foi mutado no segundo codão ATG, usando mutagénese dirigida. Células transfectadas com o I329L mutante e TLR3 foram estimuladas com poly (I:C) durante 30 minutos. Após as amostras das células previamente lisadas após o estímulo terem sido transferidas para uma membrana por Western blot e reveladas com anticorpo anti-HA, foi possível ver que a banda de 35 kDa tornou-se ausente no mutante. Tal indicou que o I329L pode ser traduzido por ambos os codões AUG, originando dois produtos diferentes. De modo a verificar que o produto originado a partir do segundo AUG é funcional, foram feitos ensaios de luciferase, medindo a activação do IFN-β após a activação de células a expressar o TLR3, estimuladas com poly (I:C) e sobre expressão do TRIF. Os resultados demonstraram que ambos os constructs (o I329L de tamanho completo e o “curto”) eram funcionais, podendo inibir a activação do TLR3 pela via do IFN-β após estimulação com dsRNA. Foi igualmente demonstrado que a inibição deriva do domínio extracelular ao interferir com a estimulação por poly (I:C) e deriva do domínio intracelular ao interagir com a sinalização mediada por TRIF. Como o TLR3 se localiza nos endossomas, foi igualmente importante verificar a localização intracelular do I329L após estimulação com poly (I:C). Para tal, células foram cultivadas em lamelas e transfectadas com plasmídeos contendo a sequência completa ou “curta” do I329L marcado com as “tags” Myc e HA. Foi possível visualizar que ambas as formas se encontravam no endossoma, provando que seguem vias semelhantes de localização intracelular. Infelizmente as experiências realizadas com o anticorpo para a “tag” do Myc não deu um bom sinal para poder analisar a localização com mais afinco. Por último, de forma à responder à questão do segundo objectivo, foi necessário transfectar células com o plasmídeo contendo o I329L completo, e após estimulo com poly (I:C), revelar as amostras transferidas por Western blot com um anticorpo para Myc. De modo desapontante os resultados foram inconclusivos devido ao alto ruído de fundo, que impediu verificar correctamente as bandas apresentadas. Em todo o caso, foi possível observar que após 30 minutos de estímulo com poly (I:C), a banda de 50 kDa desapareceu, o que não descartou a hipótese de um processamento proteolítico do I329L completo, e é necessário mais investigação sobre o assunto. Resumindo e concluindo, I329L é uma proteína antagonista de TLR3 com duas formas funcionais sintetizadas a partir do primeiro e do segundo codão AUG, capazes de inibir a activação de IFN-β extracelularmente por dsRNA e intracelularmente pelo TRIF; ambas co-localizam nos endossomas, e existe ainda a possibilidade do I329L ser processado como um TLR3. Para trabalho futuro é necessário confirmar as conclusões obtidas pelos ensaios funcionais de luciferase, fazendo análises de expressão por microarrays, de modo a comparar os domínios extracelulares dos I329L completo e “curto”, o que pode ser importante para futura exploração da sua capacidade de manipulação celular tal como da resposta imune. Adicionalmente, também é importante determinar se o I329L traduzido a partir do segundo AUG é igualmente produzido em células infectadas com o VPSA de modo a perceber melhor o mecanismo de acção do I329L após infecção viral.
