Identification of cellular targets for specific therapies in neurodevelopmental disorders

• Author(s): Vaz, Ana Rita Mendonça, 1984-
• Date: 2010
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/2476
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Biologia celular; Biologia molecular; Stress oxidativo; Tese de doutoramento - 2010
• Document Type: Doctoral thesis
• Language: English
• Advisor(s): Brites, Dora, 1951-; Brito, Maria Alexandra de Oliveira Silva Braga Pedreira de, 1960-
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de doutoramento, Farmácia (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2010

The present dissertation is focused in neonatal hyperbilirubinemia, a very common condition in the neonatal period, characterized by increased concentrations of unconjugated bilirubin (UCB). High levels of UCB may lead to bilirubin-induced neurologic dysfunction (BIND), particularly in premature infants, which may be a starting point to the appearance of long-term neurodevelopment disabilities. In cultures isolated from rat brain, toxicity induced by UCB is more pronounced in neuronal cells that in those from glia, and immature cells are more prone to this injury. Among the UCB-induced cytotoxic effects, are the extracellular accumulation of glutamate and the up-regulation of inflammatory pathways (mainly in glial cells), permeabilization of the mitochondrial membrane (in isolated mitochondria), impairment of neuritic development (in immature cortical and hippocampal neurons) and oxidative stress (in differentiated neurons). Firstly, we intended to better understand the mechanisms of neurotoxicity by UCB, mimicking a condition of prematurity, regarding oxidative stress, mitochondrial dysfunction associated with bioenergetic alterations and cell death, as well as to study the role of known modulators of oxidant species production in the prevention of UCB-induced neuronal injury. The obtained results showed that rat immature cortical neurons exposed to UCB undergo oxidative stress, mitochondrial dysfunction associated with respiration failure and cell death, effects that are prevented in the presence of glycoursodeoxycholic acid, a compound with antioxidant and anti-inflammatory properties. In addition, since prematurity is often associated with sepsis, these studies evaluated the additional effects of inflammation on hyperbilirubinemia. We demonstrated that UCB induced nitrosative stress, c-Jun N-terminal kinases 1 and 2 signalling and cell death and that these effects are intensified by pro-inflammatory cytokines tumor necrosis factor-α and interleukin- 1β, through the same cascade of mediators. Finally, it was investigated whether there is a dissimilar brain regional susceptibility to UCB-induced oxidative damage and neurite outgrowth and branching disruption in immature neurons, which might determine the preferential UCB deposition and brain damage in specific brain areas characteristic of kernicterus, such as cerebellum and hippocampus, and also the mechanisms that are involved in the modulation of UCB-induced neurotoxicity. Rat hippocampal neurons were the most susceptible to UCB-induced oxidative and nitrosative stress, as well as to UCB-induced neuritic impairment and cell death. N-acetylcysteine, a precursor of glutathione synthesis, was able to counteract the UCB-induced neurotoxicity. Taken together, these studies will substantiate target-driven approaches to the prevention and treatment of BIND, and provide fruitful opportunities for future investigations.

A presente dissertação é dirigida para o estudo da hiperbilirrubinémia neonatal, uma situação clínica frequente durante a primeira semana de vida, resultante da elevação das concentrações da bilirrubina não conjugada (BNC). A disfunção neurológica induzida pela bilirrubina (DNIB) poderá ser o ponto de partida para algumas doenças do neurodesenvolvimento, especialmente nos bebés prematuros. Utilizando modelos de culturas celulares obtidas a partir de cérebro de rato, verificou-se que a toxicidade induzida pela BNC é mais pronunciada em neurónios do que em astrócitos, sendo as células mais jovens particularmente susceptíveis. Do vasto leque de mecanismos moleculares envolvidos na toxicidade induzida pela BNC, destacam-se a acumulação de glutamato extracelular e a resposta inflamatória (nas células gliais), a diminuição do desenvolvimento neurítico (em neurónios do córtex e do hipocampo) e o stresse oxidativo (em neurónios diferenciados). Numa primeira fase, este trabalho teve como objectivo compreender os mecanismos associados à lesão pela BNC, no que respeita ao stresse oxidativo, disfunção mitocondrial e morte celular, assim como avaliar o efeito protector do ácido glico-ursodesoxicólico (AGUDC), um composto com propriedades anti-oxidantes, em condições que mimetizam uma situação de prematuridade. Para tal foram utilizadas culturas de neurónios corticais com 3 dias, obtidos de cérebros de rato. Neste modelo, a exposição à BNC conduziu ao stresse oxidativo, disfunção da respiração mitocondrial, e consequente morte celular, efeitos que foram prevenidos na presença do AGUDC. De seguida, avaliaram-se os efeitos adicionais da incubação concomitante da BNC com as citocinas pro-inflamatórias, mimetizando uma reacção inflamatória associada à hiperbilirrubinémia. Utilizando o mesmo modelo, observou-se que tanto o stresse nitrosativo, como a morte celular surgem aumentados após esta a incubação concomitante da BNC com as citocinas proinflamatórias, estando envolvidos os mesmos mediadores e vias sinalizadoras. Por fim, investigou-se de que forma o padrão de deposição específico da BNC encontrado na patologia de kernicterus é determinado pela diferente vulnerabilidade regional à lesão oxidativa e ao desenvolvimento neurítico pela BNC. Para tal, isolaram-se neurónios não só do córtex mas também do hipocampo e do cerebelo de rato. Os neurónios do hipocampo mostraram ser mais susceptíveis ao stresse oxidativo e nitrosativo induzidos pela BNC, assim como à disfunção do desenvolvimento neurítico e à morte celular. A incubação com o precursor da síntese da glutationa N-acetilcisteína preveniu os efeitos tóxicos induzidos pela BNC. Em conclusão, estes resultados contribuem para o melhor conhecimento dos mecanismos moleculares subjacentes à DNIB no período neonatal, tendo as moléculas com capacidade anti-oxidante um efeito notório na prevenção desta disfunção.

projectos FCT-POCTI/SAU/MMO/55955/2004, FCT-PTDC/SAU-NEU/64385/2006 concedidos à Professora Doutora Dora Brites pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), sendo que a Autora usufruiu de uma bolsa de Doutoramento (SFRH/BD/30292/2006) concedida pela FCT, Lisboa, Portugal.