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Iridovírus da fauna portuguesa: contributo para a caracterização molecular e avaliação da suscetibilidade a antivirais

Author(s): Figueiredo, Jorge André Mocho

Date: 2017

Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/31260

Origin: Repositório da Universidade de Lisboa

Subject(s): Iridoviridae; Atividade antiviral; Citotoxicidade; Caraterização molecular; Teses de mestrado - 2017; Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Biológicas; Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Biológicas; Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Biológicas


Description

Os Iridoviridae são vírus com um genoma de cadeia dupla de DNA com de 140 a mais de 200 kpb, circularmente permutado e com redundância terminal. São infeciosos para invertebrados como insetos ou crustáceos e para vertebrados heterotérmicos. Nesta família estão incluídos cinco géneros: Iridovirus, Chloriridovirus, Ranavirus, Megalocytivirus e Lymphocytivirus. Neste trabalho foram avaliados apenas vírus do género Ranavirus. A estirpe tipo é o Frog vírus 3 (FV3) cujo ciclo replicativo, que tem servido de modelo para todos os membros da família, inicia-se no núcleo da célula hospedeira e completa-se no citoplasma, particularidade esta que faz com que os iridovírus sejam inseridos no grupo Nucleo-cytoplasmic large DNA viruses (NCLDV). Os iridovírus são considerados patogéneos emergentes, sendo responsáveis por graves perdas económicas em peixes de aquacultura e por declínios bruscos e acentuados de populações de répteis e anfíbios. Dada a quase ausência de antivirais efetivos para estes vírus, decidiu-se avaliar se um extrato aquoso de Solidago virgaurea L. (família Asteraceae), com efeito anti-herpético demonstrado no nosso laboratório, também possuía algum efeito sobre os iridovírus. Todos os ensaios de atividade antiviral envolveram a titulação dos vírus tratados e/ou produzidos na presença do extrato e ulterior comparação dos títulos obtidos relativamente às situações controlo, sem tratamento. Nas experiências realizadas neste trabalho, que implicaram a produção, replicação e titulação de vírus, foram utilizadas as linhas celulares Vero e Vero E6. O extrato aquoso (designado por E6 neste trabalho) foi preparado por decocção de caules e folhas verdes. Fez-se a sua análise por HPLC, tendo-se avaliado a sua citotoxicidade relativamente à linha celular Vero E6, em culturas com dois níveis de confluência celular. A concentração que reduz para 50% a viabilidade celular (CC50) é de 255,3 μg/mL nas culturas mais confluentes e de 172,8 μg/mL nas culturas menos confluentes. Os efeitos de E6 a 100 μg/mL (concentração com uma citotoxicidade inferior a 10%) sobre a partícula viral (efeito virucida) e na produção de novas partículas virais num único ciclo replicativo foram avaliados. Os resultados apontam para a inexistência de efeito virucida, tendo sido confirmada a inibição da produção de novas partículas virais em células infetadas na presença do extrato. Com estes ensaios, foi possível determinar a concentração de extrato que reduz a produção viral em 50% e em 90% (respetivamente IC50 e IC90) nas duas linhas celulares. Para Vero o IC50 é 36,7 μg/mL e o IC90 é 94,3 μg/mL enquanto para Vero E6 o IC50 é 18,8 μg/mL e o IC90 é 47,3 μg/mL. Com estes resultados, determinou-se o índice de seletividade (SI) que relaciona os valores obtidos de IC50 e CC50, sendo de 9,22 para Vero E6. Dado existirem no nosso Laboratório vários isolados de ranavírus ainda insuficientemente caracterizados, estes foram utilizados como contributo para a confirmação e aprofundamento das ferramentas moleculares de caracterização destes vírus. Foram avaliados e comparados através da análise de variabilidade do número de nucleótidos uma região microssatélite, pela pesquisa da existência ou não de uma deleção num gene codificante para um fator de virulência putativo (vIF-2α) e ainda por sequenciação parcial de um gene codificante para uma proteína de reparação de DNA putativa, habitualmente não considerada neste tipo de análises comparativas. Estas abordagens foram levadas a cabo com amplificação de DNA viral por PCR, utilizando primers específicos para cada uma destas regiões, previamente descritos ou desenhados por nós. Para o estudo da região microssatélite foi necessário otimizar as condições de eletroforese, tendo-se concluído que a melhor resolução para a dimensão dos amplicões a avaliar, era obtida em geis de agarose a 4% em tampão SGTB (GRiSP Research Solutions, Portugal). Os produtos de eletroforese foram analisados no software Image Lab (Bio-Rad Laboratories) e desta análise resultou a deteção de uma diferença de um nucleótido entre os isolados BoA, Ma3A, Ma3B, MaP3 e o isolado 2000/99, o que não garante uma diferenciação segura entre estes isolados. Entre os isolados FV3 e LMo resultou uma diferença de quatro nucleótidos, como já observado anteriormente por outros autores. Quanto ao gene vIF-2α, foram obtidos produtos de amplificação com cerca de 1050 pb para os isolados BoA, Ma3A, Ma3B, MaP3 e 2000/99 e com cerca de 250 pb para os isolados FV3 e LMo, confirmando-se a existência de vírus com uma deleção neste gene, não sendo o caso dos isolados portugueses em avaliação, que também não se distinguem entre si e do isolado 2000/99. Relativamente ao gene codificante para a proteína de reparação de DNA putativa, foi necessário desenhar primers específicos para esta região, tendo por base as sequências conhecidas dos vírus FV3 e 2000/99. As amostras foram amplificadas com sucesso e sequenciadas por método de Sanger. No alinhamento das sequências obtidas, com cerca de 1030 nucleótidos, não foram detetadas diferenças entre os isolados BoA, Ma3A, Ma3B, MaP3 e 2000/99, tendo sido detetada a diferença em apenas um único nucleótido, entre FV3 e LMo. Este resultado e a diferença no número de nucleótidos encontrada na região microssatélite, permitem propor que os vírus LMo e FV3 são estirpes diferentes da mesma espécie. Os resultados deste trabalho realçam a necessidade de identificar outras regiões do genoma dos iridovírus que permitam uma melhor discriminação entre estirpes afins.

Iridoviridae are viruses with a double-stranded DNA genome with 140 to more than 200 kbp, circularly permuted and terminally redundant. They are infectious to invertebrates like insects or crustaceans and to ectothermic vertebrates. Five genera are included in this family: Iridovirus, Chloriridovirus, Ranavirus, Megalocytivirus e Lymphocytivirus. In this project, only the genus Ranavirus was evaluated. The type strain is Frog virus 3 (FV3) whose replication cycle, which has served as model for all members of this family, initiates in the host cell nucleus and completes in the cytoplasm, this feature giving iridovirus a place in the Nucleo-cytoplasmic large DNA viruses (NCLDV) group. Iridovirus are considered emerging pathogens, being responsible for severe economic loss in aquacultures and for sudden and sharp population declines in reptiles and amphibians. Given the lack of effective antivirals for these viruses, we decided to evaluate if an aqueous extract from Solidago virgaurea L. (Family Asteraceae), with positive anti-herpetic effect proven in our laboratory, also has any effect against iridoviruses. All the assays of antiviral activity involved the titration of treated viruses and/or produced in the presence of extract and posterior comparison of the obtained titers relative to the controls, without any treatment. The experiments in this project that involved production, replication and titration of viruses were carried out in Vero and Vero E6 cell lines. The aqueous extract (designed as E6 in this project) was prepared by decoction of green stems and leaves. We analyzed it by HPLC, and the cytotoxicity for Vero E6 cells, in cultures with two levels of cell confluence. The concentration that reduces cell viability to 50% (CC50) is 255.3 μg/mL in more confluent cultures and 172.8 μg/mL in less confluent cultures. The effects of E6 at 100 μg/mL (concentration with less than 10% cytotoxicity) against the viral particle (virucidal effect) and in the production of new viral particles during a single replication cycle were evaluated. Results point to the absence of virucidal effect and the inhibition of production of new viral particles in infected cells while in the presence of the extract. With these assays, it was possible to determine the concentration of extract that reduces viral production by 50% and 90% (respectively IC50 e IC90) in both cell lines. For Vero the IC50 is 36.7 μg/mL and the IC90 is 94.3 μg/mL while for Vero E6 the IC50 is 18.8 μg/mL and the IC90 is 47.3 μg/mL. With these results, we determined the selectivity index (SI) which relates IC50 and CC50, with a value of 9.22 for Vero E6. Given that we possess several ranaviruses isolates in our laboratory still insufficiently characterized, we used them as contribution for the confirmation and deepening of the molecular tools used in characterization of these viruses. They were evaluated and compared by analyzing the variability in nucleotide numbers of a microsatellite region, searching for the existence or absence of a deletion in a gene coding for a putative virulence factor (vIF-2α) and by partially sequencing a gene coding for a putative DNA repair protein, not usually considered in these comparative analyses. These approaches were done by amplifying viral DNA by PCR, using specific primers designed in the scope of this study or previously described for each one of these regions. For the study of the microsatellite region, we needed to optimize the electrophoresis conditions, concluding that the best resolution for the dimension of the amplicons we wanted to evaluate was obtained in 4% agarose gels in SGTB buffer (GRiSP Research Solutions, Portugal). The electrophoresis products were analyzed in the Image Lab software (Bio-Rad Laboratories) which showed one nucleotide difference between the isolates BoA, Ma3A, Ma3B, MaP3 and the isolate 2000/99, which does not guarantee a safe differentiation between these isolates. A four nucleotides difference was observed between the isolates FV3 and LMo, as previously detected by other authors. Regarding the vIF-2α gene, we obtained amplification products with about 1050 bp for the isolates BoA, Ma3A, Ma3B, MaP3 and 2000/99 and with about 250 bp for the isolates FV3 and LMo, confirming the existence of viruses with a deletion in this gene, which is not the case of the Portuguese isolates under evaluation, not being possible to be distinguished between themselves and the isolate 2000/99. Regarding the gene that codes for the putative DNA repair protein, we needed to design specific primers for this region, based on known sequences of FV3 and 2000/99. The samples were successfully amplified and sequenced by Sanger method. In the alignment of these sequences, with about 1030 nucleotides, differences were not detected between the isolates BoA, Ma3A, Ma3B, MaP3 and 2000/99, and a single nucleotide difference between FV3 and LMo was observed. This result and the difference found in the microsatellite region allow proposing the viruses LMo and FV3 as different strains of the same species. The results of this project highlight the need to identify other genome regions within the iridoviruses to allow for a better distinction among close strains.

Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017

Document Type Master thesis
Language Portuguese
Advisor(s) Caeiro, Filomena,1950-
Contributor(s) Figueiredo, Jorge André Mocho
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