Author(s): Sridhara, Sree Rama Chaitanya
Date: 2017
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/34144
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): RNA; Transcrição genética; Fosforilação; Factores de processamento de serina-arginina; RNA helicases DEAD-box; Teses de doutoramento - 2017; Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Biológicas
Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2017
During transcription, RNA is synthesized by RNA polymerase II (RNA Pol II) using the information contained in the template DNA strand. RNA synthesis occurs inside the transcription bubble where the two strands of DNA are physically separated and the nascent transcript is hybridized to template strand through a ~8 base pair (bp) RNA-DNA hybrid. Latter, the molecular structure of the elongating RNA Pol II ensures that the nascent transcript leaves the transcription bubble physically separated from the template DNA. Therefore, it was widely believed that RNA-DNA hybrids were only transient byproducts of transcription. However, the past decade of research has shown those R-loops − RNA-DNA hybrids and a displaced single-stranded DNA−are abundant structures that play important roles in regulating gene expression and DNA recombination. Besides these physiological roles, R-loops also pose great threats to genome stability and should therefore be tightly regulated. Cells regulate the level of R-loops by employing enzymes like DNA/RNA helicases and nucleases to resolve the RNA moiety of R-loops. Additionally, various RNA processing factors are also known to prevent R-loop formation by sequestering the nascent RNA, thus preventing it from re-annealing to the template DNA. However, the signalling cascades and molecular switches that lead to the mobilization and activation of R-loop suppressors are essentially unknown. The activity of several RNA processing factors is regulated through phosphorylation, which in many cases is driven by serine/arginine protein kinases (SRPK) 1 and 2. These kinases phosphorylate the arginine-serine (RS) domain of various RNA processing factors classified as SR-proteins. Phosphorylation/de phosphorylation cycles regulate the function of SR-proteins and the timely binding to cis regulatory elements on the nascent RNA. However, the roles of both SRPK1 and SRPK2 in R-loop metabolism and genome stability have not yet been investigated. Herein, we identify a new role for RPK2 in preventing genomic instability through a mechanism involving the suppression of R-loops. We show that phosphorylation of the DEAD box helicase-DDX23 is necessary and sufficient to restore the genome stability in SRPK2-deficient cells through a process that requires its helicase activity. DDX23 is part of the spliceosomal U5 small nuclear ribonucleoprotein complex (U5 snRNP). We found that the role of DDX23 in suppressing R-loops does not require a functional U5 snRNP as depletion of either PRP8 or PRP6, core components of the U5 1 2 snRNP, does not drive genomic instability. Altogether, we found that phosphorylation of DDX23 by SRPK2 is a crucial event to maintain cellular R-loop levels, failure of which severely compromises genome integrity. Co-transcriptional R-loops impact on RNA Pol II transcription dynamics. For instance, they are involved in promoter-proximal pausing and promote efficien transcription termination by slowing down RNA Pol II facilitating the timely recruitment of termination factors. Here we describe a new pathway that employs oscillations in RNA Pol II dynamics as a molecular sensor to signal the location of R-loops and nucleate SRPK2-dependent DDX23 phosphorylation. This may constitute a new genome caretaker mechanism that would operate to ward off against tumour-driving DNA damage. Supporting this view, we observed that loss of DDX23 is a prevalent feature of adenoid cystic carcinoma, an aggressive salivary gland cancer with very limited treatment options mostly due to our incomplete understanding of its genomic foundations and molecular basis.
Durante a transcrição, os transcritos de RNA são sintetizados pela RNA polimerase II (RNA Pol II) a partir da informação contida na cadeia de DNA. A síntese de RNA ocorre dentro da bolha de transcrição onde as duas cadeias de DNA são fisicamente separadas e o RNA nascente forma um híbrido RNA-DNA de aproximadamente 8 pares de bases com a cadeia molde. No entanto, a estrutura molecular da RNA Pol II assegura que o transcrito nascente seja fisicamente separado do DNA aquando da sua saída do local activo da enzima. Por esta razão, foi, até há pouco tempo, amplamente aceite que as estruturas híbridas de RNA-DNA seriam apenas produtos transientes da transcrição. Contudo, uma década de investigação demonstrou que híbridos de RNA-DNA se formam igualmente não é jusante da bolha de transcrição, originando, juntamente com cadeia de DNA desemparelhada, estruturas que se designam R-loops. Os R-loops são importantes para a regulação da dinâmica da transcrição e em diversos processos celulares, tais como a recombinação e a reparação de DNA. No entanto, os R-loops representam também uma grande ameaça à estabilidade genómica e devem por isso ser mantidos dentro de níveis fisiológicos. Em condições normais, as células regulam os níveis fisiológicos de R-loops através de enzimas como helicases de DNA/RNA e nucleases (como RNase H) de forma a separar ou digerir a fração de RNA dos R-loops, respetivamente, com o intuito de manter a conformação do DNA nativo. Além disso, são conhecidos vários fatores de processamento de RNA que impedem a formação de R-loops, sequestrando o RNA nascente e impedindoo de se ligar ao DNA, prevenindo assim a instabilidade genómica associada à formação de R-loops. Por exemplo, o fator de ligação SRSF1 é conhecido por prevenir a instabilidade genómica mediada por R-loops. Contudo, as cascatas de sinalização e as vias moleculares que conduzem à sua mobilização e ativação são essencialmente desconhecidas. A atividade de diversos fatores de processamento de RNA é regulada através da fosforilação que é, em muitos casos, conduzida por proteínas quinase de serina/arginina (SRPK) 1 e 2. Estas quinases fosforilam domínios de arginina-serina (SR) de vários fatores de processamento de RNA classificados como proteínas-SR e regulam a sua função. O ciclo de fosforilação e desfosforilação prejudica a regulação da função das proteínas-SR e a sua ligação atempada aos elementos reguladores cis do RNA nascente. No entanto, a função das SRPK1 e SRPK2 no metabolismo de R-loops e na estabilidade do genoma ainda não foi desvendada. Neste trabalho identificámos uma nova função associada à proteína SRPK2 na prevenção da instabilidade genómica. Para além disso, verificámos que a instabilidade genómica observada na ausência de SRPK2 é um fenómeno dependente da transcrição, mais concretamente da formação de R-loops. Na procura da base molecular desta observação, identificámos a DDX23, uma helicase DEAD box com um domínio RS na porção N-terminal, como sendo o substrato da proteína SRPK2 responsável por prevenir a instabilidade genómica mediada por R-loops. Mostrámos que a perda individual destas duas proteínas resulta na acumulação de níveis elevados de R-loops, que posteriormente conduzem a quebras no DNA. Adicionalmente, células com depleção de SRPK2 e DDX23 possuem aberrações cromossómicas condicentes com a elevada instabilidade genómica observada. O nosso trabalho revelou que a fosforilação da proteína DDX23 é necessária e suficiente para restaurar a estabilidade genómica em células com depleção de SRPK2 através de um processo que envolve a sua função de helicase de RNA. Embora a proteína DDX23 faça parte do complexo ribonucleoproteíco U5 snRNP do spliceossoma, demonstrámos que o seu papel na supressão de R-loops não necessita e um U5 snRNP funcional, uma vez que a depleção de PRP8 ou PRP6, componentes principais de U5 snRNP, não gera instabilidade genómica. De forma a investigar o processo através do qual a SRPK2 reconhecia a presença dos R-loops, fosforilando a DDX23 de modo a suprimi-los, identificámos a pausa da RNA Pol II promovida pelos R-loops como factor central neste mecanismo. Assim, na presença de um R-loop, a RNA Pol II pausa a sua elongação, o que denuncia a localização do Rloop e promove o recrutamento de SRPK2 e a fosforilação da DDX23. Assim, este processo constitui um novo mecanismo zelador da integridade genómica que atua de forma a evitar danos no DNA que poderiam potenciar a formação de tumores. Suportando este modelo, observámos que a inexistência do locus do DDX23 é uma característica frequente no Carcinoma Adenóide Cístico, um cancro muito agressivo das glândula salivares e com oportunidades de tratamento limitadas devido ao conhecimento incompleto da sua base genética e molecular. Em resumo, este trabalho permite-nos concluir que oscilações na dinâmica da RNA polimerase II constituem um sensor molecular de R-loops que pode prevenir eventos potencialmente catastróficos qu inviabilizam a manutenção da estabilidade genómica.
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