Author(s): Almeida, Ana Catarina da Silva
Date: 2017
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/34243
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): via de sinalização JAK/STAT3; STAT3; astrogliogénese; BiFC; Teses de mestrado - 2017; Ciências da Saúde
Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017
A via de sinalização JAK/STAT3 (do inglês Janus Kinase/ Signal transducer and activator of transcription 3) é uma via intracelular envolvida em múltiplos processos relacionados com crescimento celular, diferenciação, proliferação e apoptose. Esta é também a via canónica envolvida em processos de diferenciação de astrócitos e responsável pela formação da cicatriz glial devido a lesões do sistema nervoso. A ativação desta via de sinalização inicia-se com a ligação de hormonas, fatores de crescimento ou citoquinas ao seu respetivo recetor, induzindo uma mudança conformacional no mesmo. Para o sinal ser propagado, as subunidades citoplasmáticas do recetor têm de estar ligadas a JAKs. As JAKs possuem domínios cinase no seu C-terminal, que trans-fosforilam o recetor e providenciam locais para a ligação de STAT3. As JAKs fosforilam também STAT3 em resíduos específicos de tirosina (Tirosina705). O paradigma original desta via de sinalização indicava que STAT3 dimerizava apenas quando fosforilado. No entanto, existem evidências recentes de que este fator de transcrição já se encontra na forma de dímeros estáveis no citoplasma. O passo final da via de sinalização é a translocação dos dímeros fosforilados para o núcleo e a sua ligação a sequências específicas em genes alvo, denominadas de SREs (do inglês STAT3-responsive elements). A JAK/STAT3 pode ser ativada pela ligação a diferentes tipos de recetores, incluindo recetores sem atividade tirosina cinase, recetores com atividade tirosina cinase ou recetores acoplados a proteína G. Na via de sinalização clássica, as citoquinas ligam-se a recetores sem atividade tirosina cinase. Entre estes recetores, os recetores da família gp130 (glicoproteína 130) são os de maior interesse para este trabalho, visto que o sinal mediado pela gp130 induz a diferenciação de astrócitos pela JAK/STAT3. A transdução através da JAK/STAT3 é realizada por uma série de fosforilações e interações entre proteínas, pelo que para o estudo de todos os passos da mesma é necessário a identificação de interações proteína-proteína especificas. Os métodos mais correntes envolvem danos para as células vivas. Deste modo, utilizámos o método de complementação de fluorescência bimolecular (BiFC, das siglas em inglês) para o estudo da via de sinalização JAK/STAT3 em células vivas. O sistema Venus-STAT3 BiFC utilizado baseia-se na ligação de dois fragmentos não-fluorescentes da proteína fluorescente Venus a STAT3. Quando STAT3 dimeriza, as duas metades de Venus ficam suficientemente próximas reconstruindo o fluoróforo, e ocorre fluorescência. Esta fluorescência foi medida por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. Para aferir a funcionalidade do sistema, testámos o comportamento dos dois construtos do sistema Venus-STAT3 BiFC (V1-STAT3 e V2-STAT3) em células vivas. A fluorescência ocorreu apenas nas células transfetadas com os dois construtos, demonstrando que a dimerização de STAT3 ocorre de forma espontânea. Em trabalhos anteriores a este, foi demonstrado que STAT3 não dimerizou com outras proteínas que continham a metade complementar da proteína Venus. Estes dados sugerem que a fluorescência é específica e indicativa da dimerização espontânea de STAT3 inativo. Estudámos também o comportamento dos dímeros de STAT3 face a estímulos com citocinas. Verificámos que nas células estimuladas, há translocação de toda a fluorescência para o núcleo. No entanto, não se observou nenhum aumento do número de dímeros nas células estimuladas. Estudámos também um inibidor de STAT3, denominado Stattic. Na presença deste inibidor, verificámos uma diminuição do número de dímeros, para além de uma inibição da ativação da proteína (por inibição da fosforilação no resíduo Tirosina705) e da translocação para o núcleo. Visto que o sistema Venus-STAT3 BiFC conferiu informação direta sobre a dimerização e translocação de STAT3 para o núcleo, decidimos realizar rastreios moleculares. Testámos uma série de complexos dinuclares macrocíclicos, sintetizados pelo grupo da Drª Rita Delgado (ITQB-NOVA, Lisboa). Encontrámos 3 complexos macrocíclicos de zinco, com capacidade de inibir a fosforilação de STAT3 e a sua translocação para o núcleo. Neste momento, estamos ainda a realizar testes para confirmar estes resultados e para melhor compreender qual o mecanismo pelo qual ocorre esta inibição. Visto que a fosforilação é um evento tão importante na ativação da JAK/STAT3, pretendíamos determinar se outras vias de fosforilação tinham um papel determinante na dimerização espontânea de STAT3. Para isso, realizámos também um rastreio molecular numa libraria de inibidores de cinases. De uma parte desta libraria testada durante a realização deste trabalho, encontrámos um composto que inibiu a dimerização de STAT3. Na restante libraria, existe um outro inibidor que tem a mesma cinase como alvo. Neste momento, existem outros colegas de laboratório a testar este composto. O sistema Venus-STAT3 BiFC usado neste trabalho mostrou ser uma ferramenta muito útil no estudo da dimerização e translocação nuclear de STAT3. Para além de ser utilizado como uma ferramenta para análise de possíveis moduladores farmacológicos da JAK/STAT3, permite também descobrir novos intervenientes desta via. Fora do contexto desta via de sinalização, é um sistema que pode ser usado para o estudo de interação de inúmeras outras proteínas e em diferentes contextos biológicos.
The JAK/STAT3 pathway is an intracellular signaling pathway involved in many cellular processes, such as cellular growth, differentiation, migration or apoptosis. It is also activated upon astrocyte differentiation and is the main pathway responsible for astrocyte reactivity upon central nervous system (CNS) injury. Signal transduction occurs by a series of phosphorylation and protein-protein interactions, including the rate-limiting step of STAT3 dimerization. Here, we optimized a Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) assay to study STAT3 dimerization in living cells. This Venus-BiFC system is based on the fusion of two non-fluorescent halves of the Venus fluorescent protein to STAT3. When STAT3 dimerizes, the two halves of the Venus fluorescent protein become close enough to reconstruct the fluorophore, producing fluorescence. This fluorescence was measured by conventional methods such as flow cytometry or fluorescence microscopy. With this Venus-BiFC system, we found that STAT3 dimerizes prior to activation. We also used the system to perform molecular screenings. We found that 3 dinuclear macrocyclic complexes (synthetized by Dr. Rita Delgado group, ITQB-NOVA, Lisbon) were able to inhibit STAT3 phosphorylation and translocation to the nucleus. In another molecular screening, we also identify one possible kinase inhibitor that inhibited STAT3 dimerization. This Venus-BiFC system showed to be a very valuable tool to study STAT3 dimerization and can be used to study other protein-protein interactions and/or to identify novel possible therapeutic targets for human disorders.
