Author(s): Costa, Ana Carolina Ramos
Date: 2017
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/34293
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Inborn errors of metabolism; Phenylketonuria; Pharmacological Chaperones; Proteostasis Regulators; Chitosan Nanoparticles; Teses de mestrado - 2017; Ciências da Saúde
Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017
This work explores distinct strategies to overcome phenylketonuria (PKU; OMIM 261600), the most common autosomal recessive disorder of amino acid metabolism caused by a deficiency of the hepatic human phenylalanine hydroxylase enzyme (hPAH; EC 1.14.16.1) and for which the available therapies rely mainly in a dietetic restriction. PKU is considered a conformational disease, with loss-of-function, where the normal balance between folding and degradation machineries (proteostasis) is displaced towards the accelerated degradation of the misfolded hPAH variants due to their decreased stability and high tendency to aggregate. Therefore, small molecules modulating either the conformation (pharmacological chaperones, PC) or the interaction of misfolded proteins with the cellular pathways involved in protein homeostasis (proteostasis regulators; PR) might enhance the concentration and/or location of the target proteins thus contributing to alleviate disease pathogenesis. From the more than 600 different disease-causing mutations identified to date, the hPAH p.G46S is an excellent model of aggregation-prone variants as it promotes self-association and fibril formation in vitro. Alternatively, enzyme reposition therapy (ERT) would be an universal therapeutic approach as it could rescue the full spectrum of PKU phenotypes. As such, this project aimed to: (i) hint a new class of PC, from an in-house compound library, inhibiting hPAH aggregation and using p.G46S as the study model; (ii) optimize the experimental conditions for further studies to validate PR involved in p.G46S degradation and; (iii) evaluate a potential drug delivery system, previously developed by the research group aiming to develop a ERT for PKU. By performing in vitro aggregation studies on recombinantly produced p.G46S and immunocytochemistry assays on transfected eukaryotic cells, two 3-hydroxyquinolin-2(1H)-one derivatives (C6 and C18) were identified as aggregation inhibitors. These are promising compounds to be used as scaffolds for further structure refinement. Additionally, cotransfection and co-immunoprecipitation experimental conditions were established in order to study the interactions of molecular chaperones and p.G46S, a fundamental step to further identify PR. Our assays, regarding the protective effect of chitosan-nanoparticles showed that in fact the nanoencapsulated hPAHwt presented a higher activity (after 4 h incubation in culture medium, at 37°C) than the naked protein (in the same experimental conditions). Overall, the obtained results will allow to continue to pursuit novel therapeutic strategies to PKU, which in case of the adaptation of cellular proteostasis approach, might be transversal to others conformational disorders.
Este trabalho explora diferentes estratégias para tratamento da fenilcetonúria (PKU; OMIM 261600), o erro hereditário do metabolismo dos aminoácidos mais comum, o qual é causado pela deficiência da enzima fenilalanina hidroxilase (hPAH; EC 1.14.16.1) e onde a restrição dietética continua a ser a principal abordagem terapêutica. A PKU é considerada uma doença conformacional, por loss-of-function da hPAH, em que o balanço normal entre o folding e a maquinaria de degradação (proteostase) se encontra deslocado no sentido de acelerar a degradação de proteínas misfolded devido à sua instabilidade e tendência para agregação. Assim, pequenas moléculas que modulem a conformação (chaperones farmacologócios, PC) ou a interação de proteínas misfolded com as vias celulares envolvidas na homeostase (reguladores da proteostase; PR) poderão modular a quantidade e/ou localização de proteínas alvo e desta forma, contribuírem para melhorar a patogénese da doença. Das mais de 600 mutações diferentes, identificadas até à data como causadoras de PKU, a hPAH p.G46S é um excelente modelo de variantes associadas a agregação proteica uma vez que, in vitro, promove auto-associação e formação de fibrilas. Alternativamente, a terapia enzimática de reposição (ERT) seria uma abordagem terapêutica universal, pois poderia atuar sobre qualquer fenótipo PKU. Deste modo, este projeto teve como objetivo: (i) desenvolver uma nova classe de PC, a partir de uma biblioteca de compostos sintetizados inhouse, com capacidade para inibir a agregação da hPAH, usando a variante p.G46S como modelo de estudo; (ii) otimizar as condições experimentais para identificar as vias de proteostase envolvidos na degradação da p.G46S de modo a identificar PR e; (iii) avaliar um potencial sistema de entrega de fármacos, previamente desenvolvido pelo grupo de investigação, que permita alcançar uma abordagem terapêutica para a PKU através de ERT. A p.G46S foi produzida em E. coli e os ensaios de agregação permitiram identificar dois derivados 3-hydroxyquinolin-2(1H)-one (C6 e C18) inibidores de agregação. Estes resultados foram corroborados em ensaios in cellulo, onde os mesmos compostos demonstraram ser promissores para serem utilizados como scaffold para refinamento da estrutura molecular. Além disso, foram otimizadas as condições experimentais de co-transfeção e coimunoprecipitação que permitirão estudar as interações entre chaperones moleculares e a p.G46S, um passo fundamental para a futura identificação de PR. Relativamente ao efeito protetor das nanoparticulas de quitosano, a proteína hPAHwt nanoencapsulada apresentou maior atividade (após 4 h de incubação em meio de cultura, a 37 ° C) do que a proteína livre (nas mesmas condições experimentais). Em suma, os resultados obtidos com este trabalho permitirão continuar em busca de estratégias terapêuticas para a PKU. De realçar que os estudos que envolvam a proteostase celular, poderão ser transversais a outras doenças conformacionais.
