Author(s): Oliveira, Susana Maria da Silva
Date: 2018
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/40035
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Rheumatoid arthritis; Celastrol; Leukocytes; Inflammation; Bone damage; Teses de mestrado - 2018; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Ciências da Saúde
Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2018
Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune inflammatory disease characterized by synovial inflammation and joint deformity. The pathogenesis of RA is mediated by several immune cells (such as monocytes, granulocytes, T and B lymphocytes) that infiltrate the synovial membrane and secrete a complex network of pro-inflammatory cytokines, chemokines and other inflammatory mediators, which perpetuate the inflammatory process associated with bone resorption and damage. RA remains an incurable, progressive and debiliting disease for the great majority of patients despite profound evolution of the therapeutics options over the last decades. Indeed, the new biotechnological treatments for RA are administered parenterally, have safety issues and constitute a significant economic burden to national health services. Thus, the development of therapeutic strategies able to control both synovial inflammation and bone erosion, with a high rate of disease remission, low incidence of side effects and low production costs is still an unmet medical need in RA. Celastrol, a bioactive component of the Chinese herb Tripterygium wilfordii, has shown significant anti-inflammatory properties in vitro and in vivo, mainly attributed to the regulation of cytokine and chemokine production, the inhibition of cell invasion and proliferation, osteoclast modulation and suppression of bone resorption. Our group has previously characterized the efficacy and safety of celastrol in an animal model of arthritis, showing a reduction of synovial leukocyte infiltration. The main goal of this work was to analyze the effect of celastrol with or without LPS stimulation on primary human leukocytes (such as monocytes, granulocytes, T and B cells and their subsets) activation, maturation, survival and apoptosis using peripheral blood samples collected from chronic RA patients (with more than 1 year of disease duration) in comparison with healthy controls, using Flow Cytometry and performing alarmarBlue® cell vitality assay. For that, we first proceeded to the optimization of the experimental conditions (assessing the optimal compounds concentrations and incubation time to be tested), where peripheral leukocytes from healthy controls (n=4) were incubated at a range of celastrol (0,001 μM, 0,01 μM, 0,05 μM, 0,1 μM, 0,3 μM, 0,5 μM and 1 μM) and LPS (2 μg/mL, 5 μg/mL and 10 μg/mL) concentrations, and under a varying incubation times (0h, 4h, 16h and 24h). After incubation, cell viability was assessed using alarmarBlue® by spectrophotometry assay, and an immunophenotyping characterization of monocytes, ii granulocytes, B and T cells was performed by Flow Cytometry. We found that incubation for 4h with celastrol 0,3 μM and LPS 10 μg/mL was the condition that showed less lymphocyte’s, monocyte’s and granulocyte’s cell death, appearing to be the best condition to be tested in the following experiments. Next, we studied the effect of celastrol in peripheral leukocytes of the recruited chronic RA patients (n=5) and healthy controls (n=10), using the pre-optimized experimental conditions. Our results have shown that celastrol had no significant effect on CD14+ monocytes, CD66b+ granulocytes, CD19+ B cell and CD3+ T cell levels, both in healthy controls and in chronic RA patients. Accordingly, the overall data about monocytes have shown that celastrol was able to diminish (after LPS stimulation) CD16 and CD115 frequency and expression, and restore HLA-DR expression and CD86 frequency and expression to basal levels in monocytes (on total CD14+ cells) from healthy controls. In addition, in chronic RA patients, celastrol was able to reduce CD115 frequency and decrease (after LPS stimulation) CD86 frequency on monocytes (on total CD14+ cells). Regarding granulocytes, our results have shown that celastrol was able to diminish CD62L expression and restore CD11b expression and CXCR2 frequency to basal levels in granulocytes (on total CD66b+ cells) from healthy controls. In chronic RA patients, celastrol was able to restore CD11b expression to basal levels in granulocytes (on total CD66b+ cells). Our data regarding T cells have shown that celastrol was able to increase central memory Th2-like cells (CXCR3-CCR6-) and effector memory Th2-like cells (CXCR3-CCR6-) frequency and restore naïve activated T helper cells (CD45RO-HLA-DR+) frequency to basal levels from healthy controls. In chronic RA patients, celastrol was able to increase memory activated T helper cells (CD45RO+HLA-DR+) frequency. Moreover, our results have shown that celastrol was able to reduce (after LPS stimulation) CXCR3 expression to basal levels in T cells (on total CD3+ cells and on T helper cells (CD3+CD4+)) from healthy controls. Concerning B cells, our findings have shown that celastrol was able to diminish RANKL and CD95 frequency on transitional B cells (IgD+CD38++) and CD95 expression on naïve B cells (IgD+CD27-) and transitional B cells (IgD+CD38++) from healthy controls. In addition, celastrol was able to restore RANKL frequency to basal levels in B cells (on total CD19+ B cells, naïve (IgD+CD27-), pre-switch memory (IgD+CD27+), post-switch memory (IgD-CD27+) B cells)) from healthy controls. Also, in healthy controls, iii celastrol was able to restore CD95 frequency and expression and FcgRIIB expression to basal levels in B cells (on plasmablasts (IgD-CD38++); restore CD95 frequency and CD21 expression to basal levels on naïve B cells (IgD+CD27-) and CD21 expression to basal levels in B cells (on total CD19+ B cells); and restore (after LPS stimulation) HLA-DR frequency to basal levels in B cells (on transitional B cells (IgD+CD38++). Celastrol seems to have a stronger effect on innate immune system cells, reducing their overall activation, differentiation and migration potential. Accordingly, celastrol is a promising candidate for further testing in the clinic for RA therapy. Furthermore, the results suggest that celastrol might also be beneficial for the treatment of a few other autoimmune diseases besides arthritis.
A artrite reumatóide (AR) é uma doença progressiva autoimune caracterizada por inflamação crónica sinovial e deformação irreversível das articulações, que pode levar à destruição da cartilagem e erosão óssea, causando incapacidade funcional e redução da esperança média de vida do doente, se não for devidamente e precocemente tratada. Inicialmente, manifesta-se através de inchaço, dor e rigidez das pequenas articulações das mãos, alastrando-se progressivamente para as articulações maiores dos joelhos e tornozelos. Deste modo, o diagnóstico e tratamento precoce e adequado é essencial para prevenir a progressão da doença e a destruição óssea e articular a ela associada. O processo inflamatório da AR é caracterizado pelo recrutamento de células imunitárias (leucócitos) da circulação sanguínea periférica para o líquido e tecido sinovial. Nesta patologia estão envolvidas células imunitárias tanto do sistema imunitário inato (macrófagos e neutrófilos) como do adaptativo (linfócitos B e T), que infiltram a membrana sinovial (que reveste as articulações) e secretam citocinas pro-inflamatórias – particularmente as interleucinas (IL)-1β, IL-6 e IL-17 e o factor de necrose tumoral (TNF) – , quimiocinas e outros mediadores inflamatórios, tornando-a hiperplásica. Assim, o tecido sinovial torna-se, maioritariamente, repleto de macrófagos e linfócitos (células B e T), enquanto que o líquido sinovial é concentrado com neutrófilos. As interações entre células apresentadoras de antigénios (APCs), células T e células B activam a resposta imunitária, levando à produção de autoanticorpos e excessiva activação de células T. Subsequentemente, estas células T activadas vão continuamente activar monócitos, macrófagos e fibroblastos sinoviais, induzindo a produção de citocinas pro-inflamatórias e quimiocinas que perpetuam o processo inflamatório, bem como mediadores de actividade óssea e enzimas com capacidade de reabsorver e destruir cartilagem e osso. Monócitos/macrófagos (precursores de osteoclastos) são induzidos a expressar RANK, que após se ligar ao seu ligando, RANKL, secretado pelos osteoblastos, estimula a sua diferenciação em osteoclastos maduros, responsáveis pela reabsorção e erosão óssea na AR. A AR é uma doença de etiologia desconhecida e que afecta cerca de 0,5% a 1% da população mundial, sendo mais frequente nas mulheres (≈75%). Apesar da profunda evolução das opções terapêuticas ao longo das últimas décadas, a AR continua a ser uma doença incurável, progressiva e debilitante para a grande maioria dos doentes. O objectivo do tratamento na AR é a remissão, que é alcançada apenas em 20% - 30% dos doentes, se v precocemente e adequadamente tratados, no entanto, a maioria experiencia efeitos colaterais graves. Os primeiros tratamentos administrados aos doentes com AR são glucocorticóides, úteis no alívio dos sintomas clínicos e na diminuição da inflamação. Contudo, por terem efeitos secundários adversos em doses elevadas, são substituídos, numa segunda fase por drogas antirreumáticas modificadoras da doença (csDMARDs) sintécticas convencionais, que incluem o metrotexato (MTX), o fármaco mais usado no tratamento da AR e eficaz no controlo da actividade e progressão da doença. Ainda assim, uma grande percentagem de doentes é não-respondedora ou deixa de responder ao tratamento, pelo que a introdução de terapias biológicas (bDMARDs), como agentes anti- TNF, IL-1β, IL6, células B e T, têem surgido como uma alternativa aos convencionais DMARDs. Mais recentemente, têem também sido desenvolvidos agentes inibidores que são pequenas moléculas (tsDMARDs), como o tofacitinib, que apesar de inovadoras, infelizmente são terapias excessivamente caras, limitando o acesso aos serviços de saúde. Para além disso, muitas destas terapias são apenas eficazes no controlo da inflamação ou no do dano ósseo, pelo que para alguns doentes nenhuma destas terapias é eficaz. Assim, o desenvolvimento de estratégias terapêuticas capazes de controlar tanto a inflamação sinovial como a erosão óssea, com uma elevada taxa de remissão da doença, baixa incidência de efeitos colaterais e baixos custos de produção ainda é uma necessidade médica não atendida na AR. O celastrol, um componente bioactivo extraído da planta chinesa Tripterygium wilfordii, que tem sido muito usado na medicina Chinesa para tratar inflamação e doenças auto-imunes incluindo a AR, foi previamente identificado pelo nosso grupo como um potencial candidato terapêutico para a AR, por inibir simultaneamente a produção das citocinas pro-inflamatórias TNF e IL-1β, directamente relacionadas com a inflamação e a degradação óssea na AR. Vários estudos têem apontado significantes propriedades anti-inflamatórias do celastrol in vitro e in vivo, maioritariamente atribuídas à regulação da produção de citocinas e quimiocinas, à inibição da invasão/infiltração e proliferação celular, modulação de osteoclastos e supressão da reabsorção óssea. Particularmente, o nosso grupo tem determinado a eficácia e segurança do celastrol num modelo animal de artrite, mostrando uma redução da infiltração leucocitária sinovial. Assim, o principal objectivo deste trabalho foi avaliar o efeito do celastrol, com ou sem estimulação de LPS, na activação, maturação, sobrevivência e apoptose de leucócitos humanos primários (monócitos, granulócitos, células B e T e suas subpopulações), utilizando amostras de sangue periférico recolhidas de doentes com AR crónica (com mais de 1 ano de duração de doença) em comparação com controlos saudáveis, recorrendo à técnica de Citometria de Fluxo vi e ao ensaio de viabilidade alamarBlue®. Para isso, primeiramente procedemos à optimização das condições experimentais (com vista à determinação das concentrações ideais de compostos e tempo de incubação a testar), onde leucócitos periféricos de controlos saudáveis (n=4) foram incubados numa gama de concentrações de celastrol (0,001 μM, 0,01 μM, 0,05 μM, 0,1 μM, 0,3 μM, 0,5 μM e 1 μM) e LPS (2 μg/mL, 5 μg/mL e 10 μg/mL), e sob tempos de incubação variáveis (0h, 4h, 16h e 24h). Após cada incubação, a viabilidade celular foi determinada usando o reagente de alamarBlue® através de um ensaio de espectrofotometria, e a caracterização imunofenotípica dos monócitos, granulócitos, células B e T, foi realizada por Citometria de Fluxo. De entre as condições testadas, verificou-se que a incubação de 4h com 0,3 μM de celastrol e 10 μg/mL de LPS foi a condição que apresentou menos morte celular das populações de linfócitos, monócitos e granulócitos, surgindo como a condição ideal a ser testada nas experiências seguintes. Em seguida, procedemos ao recrutamento de doentes com AR crónica (n=5) e controlos saudáveis (n=10) e estudámos o efeito do celastrol em leucócitos periféricos, testando as condições experimentais pré-optimizadas. O nosso trabalho demonstrou que o celastrol não teve efeito significativo nos níveis de células CD14+ (monócitos), CD66b+ (granulócitos), CD19+ (células B) e CD3+ (células T), tanto nos indíviduos saudáveis como nos doentes com AR crónica. Em relação aos monócitos, o celastrol mostrou ser capaz de diminuir (após estimulação com LPS) a frequência e a expressão de CD16 e CD115, e restaurar a expressão de HLA-DR e a frequência e expressão de CD86 para níveis basais nas células CD14+ totais de controlos saudáveis. Além disso, nos doentes com AR crónica, celastrol foi capaz de reduzir a frequência de CD115 e diminuir (após estimulação com LPS) a frequência de CD86 nas células CD14+ totais. No que diz respeito aos granulócitos, o celastrol foi capaz de reduzir a expressão de CD62L e restaurar a expressão de CD11b e a frequência de CXCR2 para níveis basais nas células CD66b+ totais de controlos saudáveis. Nos doentes com AR crónica, o celastrol foi capaz de restaurar a expressão de CD11b para níveis basais nas células CD66b+ totais. Quanto às células T, o celastrol foi capaz de aumentar a frequência de células central memory Th2-like (CXCR3-CCR6-) e effector memory Th2-like (CXCR3-CCR6-) e restaurar a frequência das naïve activated T helper (CD45RO-HLA-DR+) para níveis basais de controlos saudáveis. Nos doentes com AR crónica, o celastrol foi capaz de aumentar a frequência de células memory activated T helper (CD45RO+HLA-DR+). Para além disso, o celastrol foi capaz de reduzir (após estimulação com LPS) a expressão de CXCR3 para vii níveis basais nas células CD3+ totais e nas T helper (CD3+CD4+) de controlos saudáveis. No que concerne às células B, o celastrol foi capaz de diminuir a frequência de RANKL e CD95 nas células transitional (IgD+CD38++) e a expressão de CD95 nas naïve (IgD+CD27-) e transitional (IgD+CD38++) de controlos saudáveis. Além disso, o celastrol foi capaz de restaurar a frequência de RANKL para níveis basais nas células CD19+ totais, nas naïve (IgD+CD27-), pre-switch memory (IgD+CD27+) e post-switch memory (IgD-CD27+) de controlos saudáveis. Nos doentes com AR crónica, o celastrol foi capaz de restaurar a frequência e expressão de CD95 e a expressão de FcgRIIB para níveis basais nos plasmablasts (IgD-CD38++); restaurar a frequência de CD95 e a expressão de CD21 para níveis basais nas células naïve (IgD+CD27-) e a expressão de CD21 para níveis basais nas células CD19+ totais; e restaurar (após estimulação com LPS) a frequência de HLA-DR para níveis basais nas células transitional (IgD+CD38++). Celastrol parece ter um efeito mais forte sobre as células do sistema imune inato, reduzindo a sua activação geral, diferenciação e potencial de migração. Desta forma, celastrol é um candidato promissor para futuros ensaios clínicos em doentes com AR. Além disso, estes resultados sugerem que o celastrol também pode ser benéfico para o tratamento de algumas outras doenças autoimunes além da artrite.
