Author(s): Gomes, Adriana Andreia Silva Pires
Date: 2010
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/4555
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Proteomics; FACS isolation of CSCS; Cardiac stem cells; Membrane proteins; Nuclei proteins; Teses de mestrado - 2010
Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
Heart failure and other heart diseases are the most important death causes in developed countries. When the heart fails, it heals by scar formation, which compromises its normal ability to pump sufficient blood to meet the metabolic demands of the body. As the heart was usually viewed as a post mitotic organ, the renewal of its tissue by endogenous cells was considered non-existent. However, recent studies in which small dividing cells with stem cell surface marker were found in the heart and identified as Cardiac Stem Cells (CSCs), changed this view and gave a new perspective in therapeutic approaches to heart related diseases. As CSCs are a recent discovery, it is essential to study and characterize these cells to better understand the way in which they regenerate the heart damaged tissue, the molecular factors involved in their mobilization and differentiation and the molecular factors produced by these cells. In the present work, the membrane and nucleus of CSCs expressing the stem cell markers Sca-1 and c-Kit were isolated using differential centrifugation, and the proteome of this nuclear and membrane fractions, along with a whole cell sample for the c-kit+ CSCs was analyzed by Peptide Mass Fingerprint, using MALDI ionization coupled with FT-ICR detection, which allowed an increase in sensitivity and resolution. 122 proteins were identified, 48 for the c-kit+ CSCs and 74 for the Sca-1+ population. Uncharacterized proteins were found in both kinds of cells, along with proteins involved in the proliferation pathways common to both populations, as is the case of the Protein Chibby Homolog 1, or specific of c-kit+ population (Alpha Enolase) or to the Sca-1+ population (47 kDa heat shock protein). Other differences were found and discussed. This work is the first attempt at the unraveling of the proteome of Cardiac Stem Cells.
Até ao seculo XX, o coração era considerado um órgão pós-mitótico, sem capacidade de auto-regeneração. Estudos recentes levaram a uma mudança de paradigma, provando a existência de células estaminais no coração, Células Estaminais Cardíacas (CEC), responsáveis por uma taxa diminuta de renovação do tecido cardíaco, e revelando novas possibilidades de terapia para doenças cardíacas. Infelizmente, pouco se sabe ainda acerca dos mecanismos subjacentes à diferenciação e migração destas células, pelo que há necessidade de estudos neste sentido, exigindo uma investigação mais detalhada. No presente projecto caracterizou-se o proteoma de duas populações de Células Estaminais Cardíacas, caracterizadas por apresentarem os marcados de superfície celular c-kit e Sca-1. Através da identificação do proteoma de membrana e núcleo destas células, pretende-se obter conhecimento acerca dos mecanismos subjacentes à diferenciação e proliferação de CSCs, utilizando o modelo animal de ratinhos Balb C, com o objectivo de melhor compreender o potencial destas células na regeneração cardíaca No Capítulo 1 descreve-se com detalhe as propriedades das Células Estaminais Cardíacas. Estas células são multipotentes, pelo que podem diferenciar-se nas três linhagens cardíacas: Cardiomiócitos, Músculo Liso vascular e Células Endoteliais, e têm um papel importante na regeneração cardíaca.Estas célulasdemonstram capacidade de auto-renovação, apresentam elevada plasticidade, e possuem ainda a capacidade de se dividirem assimetricamente, gerando uma nova Célula Estaminal Cardíaca é uma célula progenitora, que se irá diferenciar numa das três linhagens cardíacas já referidas. Cada vez mais existem resultados que indicam que as proteínas secretadas pelas Células Estaminais Cardíacas na vizinhança de uma lesão cardíaca têm um papel importante na regeneração. É fundamental conhecer as vias de sinalização autócrinas e parácrinas destas células e perceber de que modo influenciam a diferenciação e migração das Células Estaminais Cardíacas. Devido a serem uma descoberta recente, pouco se sabe acerca do metabolismo e da sua biologia destas células. O conhecimento do proteoma das Células Estaminais Cardíacas é fundamental para a aplicação destas células em terapia, uma vez que a maioria das funções celulares é exercida por proteínas. O estudo do seu proteoma recorrendo à espectrometria de massa é a estratégia proposta neste trabalho. A abordagem proteómica Bottom-Up à caracterização do proteoma das CSCs permite a identificação de várias proteínas numa mistura. A amostra proteica é digerida enzimaticamente, através da incubação com trispsina, os péptidos resultantes são analisados por espectrometria de massa, e as proteínas identificadas por PeptideMassFingerprint usando o motor de busca MASCOT (www.matrixscience.com). A partir do homogenato proteico, as proteínas a identificar são separadas de acordo com a massa por electroforese unidimensional (SDS-PAGE), separando as proteínas de acordo com a sua massa molecular. Após a digestão das amostras, a mistura de péptidos é analisada por MALDI-FTICR (Matrix-Assisted Laser DesorptionIonization, com deteccao por Fourier Transform- IonCyclotronRessonanceMassSpectrometry). A análise por FTICR-MS permite a mais elevada exactidão de massa e resolução, dois factores cruciais para o sucesso da identificaçãao de proteínas em misturas complexas. O conhecimento do proteoma das Células Estaminais Cardíacas permite o acesso a informação acerca dos mecanismos que levam à migração e diferenciação das Células Estaminais Cardíacas. No Capítulo 2, é descrito o método de isolamento de Células Estaminais Cardíacas e os resultados obtidos. Ratinhos Balb C foram executados e os seus miocárdios submetidos a destruição manual e várias sequências de centrifugações e filtrações, obtendo-se uma suspensão de células cardíacas. Desta suspensão, através do uso da técnica de FluorescentActivatedCellSorting, as duas populações de Células Estaminais Cardíacas forma isoladas, utilizando sondas fluorescentes, isto é, fluorocromos conjugados com anticorpos monoclonaisanti c-kit e anti Sca-1.Citometria de fluxo é uma técnica amplamente usada para medir características de partículas biológicas. As células a serem analisadas são preparadas em suspensão celular singlecell, e o fluxo-uni-celular é bombardeado com um laser. Quando o laser atinge as células previamente marcadas com uma sonda fluorescente, a fluorescência emitida permite seleccionar e isolar estas células marcadas. A emissão de fluorescência pelas sondas utilizadas permite o isolamento das células que se ligam as mesmas. 1134807 Células Estaminais Cardíacas foram isoladas para a população c-kit+, a partir de 82 ratinhos. 77656 células foram isoladas para a população Sca-1+, a partir de 30 ratinhos, tenho esta população sido mais fácil de isolar, como previsto pela literatura. A partir das amostras obtidas no Capitulo 2, foram isoladas fracções membranares e nucleares de cada população, através do método de centrifugação diferencial, no Capítulo 3. As populações foram isoladas com sucesso, facto verificado através de Western Blott, uma vez que para a fracção membranar o marcador de membrana (Sca-1 e c-kit) é observado em maior quantidade que o marcador nuclear (phospho-Histona H3), e na fracção nuclear apenas o marcador nuclear é observado. Devido a escassez de amostras de Células Estaminais Cardíacas c-kit+, uma amostra de wholecell, isto é, extracto proteico não fraccionado contendo proteínas provenientes de todos os componentes celulares, foi também efectuada, através de 3 diferentes métodos de extracção de proteínas, uma optimização que permitiu perceber a necessidade de elevadas quantidades de células c-kit+com vista à obtenção de quantidades de proteína suficientes para a visualização por SDS-PAGE, fundamental para a última parte do trabalho desenvolvido. O estudo do proteoma das Células Estaminais Cardíacas foi desenvolvido no Capítulo 4. A partir das fracções membranares e nucleares de Células Estaminais Cardíacas c-kit+ e Sca-1+procedeu-se a separação das proteínas por SDS-PAGE, e seguidamente a digestão com tripsina das bandas do gel, obtendo um conjunto de péptidos a analisar por MALDI-FTICR. Após a análise dos espectros através de ferramentas bioinformáticas, identificaram-se 134 proteínas, 58 para as Células Estaminais Cardíacas c-kit+, e 74 para as Células Estaminais Cardíacas Sca-1+. Das 35 proteínas identificadas para a fracção wholecell de Células Estaminais Cardíacas c-kit+, 8,3% estão envolvidas nos mecanismos de proliferação celular (Stress- Induced Phosphoprotein-1, Alpha-Enolase, ProteinChibbyHomolog 1), e 11,1 % são proteínas não caracterizadas e de função desconhecida. Na fracção membranar desta população de Células Estaminais Cardíacas identificaram-se as mesmas proteínas não caracterizadas e de função desconhecida, e ainda 10% de proteínas envolvidas nos mecanismos de proliferação. Na identificação de proteínas nucleares desta população de Células Estaminais Cardíacas foram identifcadas proteínas de função ubiquitária Para a população de Células Estaminais Cardíacas Sca-1+, das 45 proteínas identificadas, 2% estão relacionadas com a proliferação celular e 4% com os processos de diferenciação celular. Todas as proteínas identificadas para a fracção membranar de Células Estaminais Cardíacas c-kit+ foram encontradas nesta fracção, demonstrando a similaridade de ambas as populações de células estaminais. No entanto, mais estudos serão necessários para determinar quais as diferenças mais relevantes entre os proteoma das duas populações de Células Estaminais Cardíacas. As proteínas identificadas na fracção nuclear de Células Estaminais Cardíacas Sca-1+ estão maioritariamente relacionadas com a regulação da transcrição e são comuns a maioria das células mamíferas, destacando-se 10% de proteínas relacionadas com a regulação da proliferação celular. Proteínas não caracterizadas foram encontradas em todas as amostras. Estas proteínas, devido a serem aparentemente muito abundantes nestas populações devem ser alvo de estudos futuros, que possibilitarão determinar o seu envolvimento em processos relevantes para a biologia de células estaminais. Ainda, algumas diferenças entre as proteínas identificadas envolvidas nos processos de proliferação e diferenciação de células estaminais deverão ser futuramente exploradas através de estudos funcionais que permitirão estabelecer um fenótipo característico de cada população destas células.
