Role of N-cadhering during somitogenesis in the chick embryo

• Author(s): Jacinto, Ana Raquel Marques
• Date: 2011
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/5649
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Embriologia animal; Embrião de galinha; Somitogénese; Teses de mestrado - 2011
• Document Type: Master thesis
• Language: English
• Advisor(s): Martins, Gabriel G.
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011

The first evidence of metamerization in the vertebrate body plan is the segmentation of the paraxial mesoderm into somites which happens early during the embryonic development. The genetics and signalling involved in the process have already been thoroughly studied, and recent works have shed some light in the morphogenetic movements that presomitic mesoderm cells undergo and during somite formation and epithelialisation. In the present work, the role of the adhesion molecule N-cadherin in sómitogenesis was studied in more detail. The expression pattern in chick embryo has previously been shown, as well as the common defects caused by the lack of N-cadherin in mouse embryo. Though apparently not fundamental for the somite formation, Ncadherin is important for the correct epithelialization. By electroporating two different truncated versions of the N-cadherin, one without the extracellular domain and another without the intracellular domain, it was visible that the somites formed had different sizes when compared with the control and other phenotypes occurred: fusions and fissions of somites. Preliminary results showed that each domain of the N-cadherin affects differently the medial, rostral and caudal epithelia in terms of number and position of cells, which suggests that both domains mediate cellular events which important for the correct epithelialization and maintenance of the epithelium. Because previous work in chick embryo suggested that the first ten formed somites were more susceptible to the impairment of N-cadherin, so the expression patterns of N-cadherin and cadherin11 were studied for these stages. The hypothesis was that both cadherins would be cooperating in the 10th somite and beyond, so cadherin11 would compensate for the lack of N-cadherin and reduce the effects visible in the first ten somites. This was not confirmed, since cadherin11 only expresses transiently in the somites first ten somites. This work sheds light into the possible role(s) of N-cadherin during early sómitogenesis.

Os sómitos são a primeira estrutura metamérica visível aquando do desenvolvimento dos vertebrados, e formam-se aos pares por segmentação da mesoderme paraxial no eixo antero-posterior, um processo ao qual se da o nome de sómitogénese. Para isto, as células mesenquimatosas da mesoderme paraxial tem de fazer uma transição mesênquima-epitélio e posicionar-se no local correcto. Esta transição exige que as células sofram várias modificações na sua morfologia, o que ocorre de uma forma dinâmica. As células na parte média da mesoderme paraxial não segmentada tornam-se progressivamente epiteliais à medida que se aproximam do momento de formarem sómitos. Algumas células mesenquimatosas ligam-se a células já epiteliais e usam-nas para elas mesmas se tornarem epiteliais, um movimento a que se dá o nome de acreção. Este movimento parece ser o principal responsável pela formação do epitélio rostral e caudal. Outros movimentos também ocorrem, culminando num sómito composto por um epitélio de células epiteliais a volta de um centro de células mesenquimatosas, o sómitocelio. A medida que o sómito passa pelo processo de maturação, o epitélio ventral dissocia-se no dermamiotomo e no esclerotomo. Estes originam no indivíduo adulto as vértebras, os discos intervertebrais, as costelas, os músculos esqueléticos e os tendões dos membros. O processo de sómitogenese é controlado no tempo, com cada par de sómitos a formar-se num intervalo de tempo específico. No caso do embrião de galinha, cada par de sómitos forma-se com um intervalo de 90 minutos. Para alguns dos movimentos ocorrerem, as células têm de conter na sua membrana moléculas que lhes permitam estabelecer ligações mais ou menos temporárias com outras células. A estas dá-se o nome de moléculas de adesão celular e podem ser classificadas em quatro grupos: integrinas, imunoglobulinas, selectinas e caderinas. O presente trabalho incidiu sobre as caderinas e sobre o seu papel especificamente na sómitogenese. Estas moléculas são glicoproteinas que medeiam uma adesão dependente de cálcio e estão geralmente implicadas no desenvolvimento embrionário, desempenhando vários papéis diferentes como segregação, condensação e rearranjo de células de estruturas em formação. Actuam como dímeros e o domínio extracelular medeia uma adesão homofílica, ou seja, adesão entre duas moléculas iguais. O domínio intracelular, por sua vez, veícula a ligação ao citoesqueleto celular. A N-caderina está presente na parte mais posterior da mesoderme paraxial, junto ao nó de Hensen, e tem uma expressão na parte não segmentada que decresce à medida que se aproxima da parte rostral. Na zona onde se está a dar a formação dos sómitos, a expressão de Ncaderina é retomada e aumenta no sómito em formação, depositando-se na parte apical das células que está virada para o centro do sómito. A expressão mantém-se até ao momento de formação do esclerotomo na parte ventral, onde o epitélio se dissocia e as células dispersam. Antes de isto acontecer, a N-caderina e sub-expressa no epitélio ventral, mantendo-se apenas a expressão no dermamiotomo. Estudos passados demonstraram que o knockout da N-caderina no embrião de ratinho leva a formação de sómitos com formas irregulares e com epitélios onde as células parecem menos coesas. No embrião de galinha, estudos feitos com um anticorpo que bloqueia esta molécula originaram também sómitos cujo epitélio apresentava defeitos. Isto sugere que a Ncaderina não é essencial para a formação do sómito, mas é importante para sua correcta epitelização do sómitos, o que influencia a forma geral do mesmo. Um dos objectivos deste trabalho foi o de perceber como é que o epitélio é de facto afectado pela falta da N-caderina. Para isso, embriões de galinha com 24 horas foram electroporados com versões diferentes de construções truncadas de N-caderina: uma cujo domínio intracelular não estava presente (cbr-) e outro cujo domínio extracelular foi também removido (Δ390). Depois da incubação os embriões foram processados e observados ao microscópio confocal. Ambos os vectores produziram defeitos: no cbr- os embriões tinham sómitos geralmente maiores ao longo do embrião; no Δ390 os sómitos S11-S14 eram geralmente maiores, enquanto que os sómitos S16-S18 eram mais curtos na medida rostral-caudal. Para ambos os vectores, os sómitos S16-S18 eram mais altos do que os do controlo, sendo que os Δ390 eram os que apresentavam o valor mais elevado. A seguir, reconstruiram-se sómitos e mediu-se o volume do epitélio e do sómitocélio para calcular o rácio mesenquima/epitélio. Isto permitiu determinar se a falta da N-caderina provocava um problema na epitelização inicial do sómito ou não. Os valores preliminares encontrados, para os sómitos mais posteriores, foram inferiores aos valores obtidos para os controlos o que sugere um problema na distribuição das células entre sómitocélio e epitélio (mais células no epitélio), e um epitélio menos compacto, traduzindo-se num epitélio maior e reduzindo o rácio. Olhando para a distribuição das células no epitélio e no sómitocelio, viu-se que os sómitos tratados com cbr- tinham um epitélio mais desorganizado do que o controlo, com mais núcleos contados e com formas mais arredondados, com mais espaço entre eles, enquanto que o sómitocélio continha menos células. Tudo isto parece justificar um rácio menor e a ocorrência de sómitos maiores. No caso dos Δ390, os sómitos têm um epitélio mais compacto, o que explica o facto de os sómitos serem menos largos, mas também tem um sómitocélio com menos células e o sómito e mais espesso dorso-ventralmente, o que explica o racio menor. Estes resultados sugerem que o domínio intracelular é importante durante a formação do sómito pois parece influenciar significativamente a forma das células e consequentemente a forma dos sómitos, e que o domínio extracelular e também importante para a correcta posição das células no epitélio, uma vez que sem ele o epitélio parece estar mais desorganizado. Dois outros fenotipos também encontrados foram fissões e fusões de sómitos. Uma fissão corresponde a dois sómitos lado a lado onde deveria estar apenas um, e uma fusão e a junção de dois sómitos pelos epitélios rostral e caudal, com partilha de sómitocelio. Estes fenotipos foram encontrados em ambos os tratamentos, mas com frequências diferentes, sendo que as fusões estavam mais associados Δ390 e as fissões mais associadas ao cbr-. Como em ambos os casos o que parece estar a falhar são os epitélios rostrais e caudais, tal fenotipo apoiam para a ideia de que a falta de um dos componentes da N-caderina perturba a correcta acreção de células para estes epitélios, pelo que estes serão mais frageis e poderão levar a este tipo de fenotipos. Num dos embriões filmado a 4D no microscópio confocal, foi visivel que o sómito formou-se normalmente mas acabou por se fundir com o sómito da frente quando o epitélio rostral colapsou. A literatura sugere que os primeiros dez sómitos no embrião de galinha são diferentes dos restantes e mais susceptíveis ao anticorpo contra a N-caderina do que os restantes. Tal poderia ser explicado se esses sómitos fossem mais dependentes de N-caderina, enquanto que os outros contariam com outras caderinas que a compensassem. A caderina11 era uma hipótese, visto que cumpre exactamente este mesmo papel no embrião de ratinho. O padrão de expressão da caderina11 foi estudado para embriões com menos e mais de 10 sómitos e foi apenas encontrado transientemente na parte lateral dos sómitos de embriões com menos de 10 sómitos, não sendo encontrado em mais nenhum ponto na mesoderme paraxial. Estes resultados parecem contradizer a hipótese inicialmente avançada, continuando a deixar sem resposta esta pergunta. Possivelmente, outras moléculas de adesão celular estarão envolvidas neste processo.