Author(s): Rocha, Mariana Frota Cúcio de Moraes, 1986-
Date: 2013
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/8413
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Amyotrophic lateral sclerosis; Neuromuscular transmission; SOD1(G39A) mice; Teses de mestrado - 2013
Tese de mestrado, Neurociências, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2013
A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), uma das doenças do neurónio motor mais comum, caracteriza-se pela perda selectiva de neurónios motores do tracto corticoespinhal. Vários estudos sugerem que a degeneração inicia-se na porção distal do axónio com uma progressão retrógrada. Assim, o presente trabalho teve como objectivo avaliar a transmissão sináptica na junção neuromuscular dos animais SOD1(G93A), nos períodos correspondentes às fases pré-sintomática e sintomática da ELA. As experiências foram efectuadas em ratinhos transgénicos SOD1(G93A) e não transgénicos (WT), na fase pré-sintomática (4 a 6 semanas de idade) e fase sintomática (12 a 16 semanas de idade). Após o nascimento, os animais foram genotipados por polymerase chain reaction (PCR). Nas respectivas fases da doença, os animais foram testados no rotarod, e em seguida fizeram-se registos electrofisiologicos: potenciais de placa evocados (EPPs), potenciais de placa miniatura (MEPPs) e MEPPs gigantes (GMEPPs: MEPPs > 1mV). Os registos foram feitos em fibras musculares do diafragma inervado, paralisadas com μ-conotoxina GIIIB. O conteúdo quântico dos EPPs foi calculado através da razão entre a amplitude média dos EPPs e a amplitude média dos MEPPs. Na fase pré-sintomática da doença, os ratos SOD1(G93A) não exibiram alterações na função motora a 10 rpm. Relativamente à transmissão neuromuscular, estes animais apresentaram um aumento significativo da amplitude média dos EPPs e do conteúdo quântico dos EPPs, quando comparados com os animais WT, sugerindo uma maior eficiência da transmissão neuromuscular nos animais SOD1(G93A). Para além disso, o aumento significativo da frequência de GMEPPs, o que pela literatura parece estar associado a uma desregulação dos níveis intracelulares de Ca2+, e as alterações na amplitude e cinética dos MEPPs sugerem a existência de alterações ao nível da junção neuromuscular numa fase pré-sintomatica. Na fase sintomática, os animais SOD1(G93A) apresentaram um défice motor aos 10 rpm. Os registos electrofisiológicos revelaram a existência de dois grupos de junções neuromusculares nos ratos SOD1(G93A): SOD1a e SOD1b. O grupo SOD1a apresentou EPPs e MEPPs com amplitudes significativamente reduzidas bem como um rise-time dos MEPPs aumentado, quando comparado com os grupos SOD1b e WT, sugerindo um enfraquecimento da transmissão neuromuscular, nesse grupo. Pelo contrário, o grupo SOD1b apresentou uma transmissão neuromuscular semelhante tanto à dos animais SOD1(G93A) pré-sintomáticos, como também à dos WT com 12-14 semanas. Em conclusão, este trabalho mostra que a transmissão neuromuscular dos animais SOD1(G93A) encontra-se aumentada na fase pré-sintomática. Na fase sintomática, a presença de uma população mista de junções neuromusculares é consistente com os ciclos de desinervação/ re-inervação, já descritos noutros estudos. As alterações iniciais na transmissão neuromuscular dos animais SOD1(G93A) representam assim mais uma evidência que os mecanismos patológicos da ELA iniciam-se antes do aparecimento dos primeiros sintomas.
Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is the most frequent adult-onset motor neuron disease and is characterized by a selective and progressive loss of motor neurons in the corticospinal tract. Growing evidence suggest that degeneration may begin at the distal axon proceeding in a dying-back pattern, increasing the need to focus on neuromuscular junction parameters. It seemed therefore of interest to investigate synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) in both pre- and symptomatic phases of the disease. Experiments were performed in SOD1(G93A) mice and in non-transgenic littermates (WT) with 4-6 and 12-14 weeks-old, corresponding respectively to pre- and symptomatic phases. After birth, mice were genotyped through polymerase chain reaction (PCR). At the respective age, mice were submitted rotarod, then low-frequency (0.5 Hz) evoked endplate potentials (EPPs), miniature endplate potentials (MEPPs) and giant MEPPs (GMEPPs: MEPPs >1mV) were recorded from innervated diaphragm muscle fibers, paralyzed with μ-conotoxin GIIIB. The quantal content of EPPs was estimated as the ratio between EPPs amplitude and MEPPs amplitude. In the pre-symptomatic phase, SOD1(G93A) mice did not present motor deficits on the rotarod at 10rpm. However, SOD1(G93A) mice exhibited a significant increase of the mean amplitude of EPPs together with an increase in the mean quantal content of EPPs, suggesting that more acetylcholine is being released into the synaptic cleft. Also, SOD1(G93A) mice presented a higher frequency of GMEPPs, suggestive of intracellular Ca2+ deregulation in nerve terminals. The observed increase in the mean amplitude of MEPPs and the decreased mean rise-time of MEPPs in SOD1(G93A) mice point as well to post-synaptic related changes. In symptomatic phase, SOD1(G93A) mice presented a lower motor balance and coordination. Electrophysiological data showed evidence for two NMJ groups in SOD1(G93A) mice: SOD1a and SOD1b. The SOD1a group presented both mean amplitude of EPPs and of MEPPs reduced. The mean rise-time of MEPPs was increased, when compared to WT and to SOD1b group, indicating an impairment in the neuromuscular transmission. In contrast, the neuromuscular transmission of SOD1b group was not different from age-matched WT or from the pre-symptomatic SOD1(G93A) mice. Altogether these results clearly show that the neuromuscular transmission of SOD1(G93A) mice is enhanced in the pre-symptomatic phase. In the symptomatic phase our results are consistent with the hypothesis that the diaphragm of SOD1(G93A) mice are undergoing cycles of denervation/re-innervation supported by the mixed population of neuromuscular junctions. These early changes in the neuromuscular transmission of SOD1(G93A) mice is a novel proof that the ALS associated events starts long before the symptoms appear.
