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Molecular switches in CFTR processing and trafficking: the role of the novel interactor Rap1A

Author(s): Fernandes, João Miguel Parente

Date: 2012

Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/9122

Origin: Repositório da Universidade de Lisboa

Subject(s): Bioquímica; Teses de mestrado - 2012


Description

A Fibrose Quística é a doença recessiva autossómica letal mais comum na população caucasiana. É caracterizada do ponto de vista clínico por um declínio rápido na função pulmonar, com obstrução das vias aéreas devido à ineficaz remoção de muco e consequentes infecções bacterianas recorrentes. Estas alterações estão associadas desde muito precocemente a um ambiente de hiperinflamação, que exacerba os processos de remodelação do tecido pulmonar e acaba por culminar na fibrose dos tecidos e perda da sua função. Além deste fenótipo respiratório, os pacientes apresentam ainda problemas digestivos graves, nomeadamente a nível pancreático, intestinal e hepático, e são inférteis no caso dos homens e de uma elevada percentagem das mulheres. A fibrose quística é causada por mutações no gene CFTR (do inglês Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) que codifica para uma proteína com o mesmo nome. Neste momento, conhecem-se cerca de 1930 mutações causadoras da doença, sendo a mais comum a delecção de três nucleótidos que correspondem ao resíduo de fenilalanina na posição 508 da proteína. Esta mutação está presente em cerca de 90% dos pacientes. Esta proteína é expressa em células epiteliais de vários tecidos, e além de funcionar como um canal de cloreto e outros aniões na membrana apical dessas células, é também responsável por regular outros canais e transportadores, tendo um impacto global no transporte iónico epitelial. A fosforilação pela proteína cinase A em resposta a aumento dos níveis de AMP cíclico é considerada o principal mecanismo responsável pela abertura do canal. Ao ser sintetizada, a CFTR é inserida co-traducionalmente na membrana do retículo endoplasmático, onde adquire a sua conformação nativa com o auxílio de vários chaperones aí presentes e sofre uma glicosilação inicial. Do retículo endoplasmático, é transportada para o Golgi, onde os seus resíduos glicídicos são processados até atingir uma forma madura, que é transportada em vesículas para a membrana plasmática, onde exerce a sua função. Uma vez na membrana, a CFTR é endocitada e segue uma de duas vias: ou é reciclada de volta para a membrana ou é enviada para degradação no lisossoma. O balanço destes processos determina a quantidade de proteína presente na membrana, e como tal são relevantes para a compreensão do defeito molecular que origina a doença. As interacções que a CFTR estabelece com outras proteínas ao longo deste trajecto são determinantes para que a proteína consiga exercer convenientemente a sua função. Recentemente, a pequena GTPase Rap1A foi identificada como potencialmente interagindo com a CFTR. O objectivo deste trabalho consistiu na validação dessa interacção e no estabelecimento de um sistema experimental que permitisse avaliar o impacto da Rap1A na biogénese, tráfego e função da CFTR. A Rap1A é uma pequena GTPase da família Ras que está activa quando ligada a GTP e inactiva quando ligada a GDP. A interconversão destas duas formas é auxiliada por proteínas reguladoras chamadas GEFs (activadores) e GAPs (inactivadores), que respondem a uma variedade de estímulos intra e extracelulares. Quando activa, a Rap1A induz alterações conformacionais em determinadas proteínas alvo, envolvidas na regulação da adesão à matriz extracelular e célula-célula, dinâmica do citoesqueleto e polarização celular, alterando a sua função. O primeiro passo do trabalho foi avaliar a expressão da Rap1A no tecido mais relevante do ponto de vista clínico, o pulmão. Para isto, realizaram-se experiências de Western Blot a partir de culturas primárias de células epiteliais dos brônquios de indíviduos saudáveis e de uma linha celular do epitélio brônquico de pacientes com fibrose quística (CFBE) que sobreexpressa CFTR. Observou-se em ambos os tipos celulares expressão da proteína. A estratégia escolhida para validar a interacção entre a CFTR e a Rap1A foi tentar co-imunoprecipitar ambas as proteínas. No entanto, não foi possível validar esta associação, tendo sido unicamente observada uma possível colocalização por ensaios de imunofluorescência. De seguida, foram produzidos com sucesso plasmídeos para expressão da Rap1A wt em fusão com GFP, bem como de um mutante constitutivamente activo e um dominante negativo. O protocolo de transfecção de células CFBE com estes plasmídeos e com siRNAs foi optimizado, embora as eficiências de transfecção atingidas tenham sido modestas. A expressão dos constructos fluorescentes foi analisada por Western Blot e revelou um problema de folding e/ou processamento, provavelmente decorrente da fusão com a GFP. A actividade dos constructos com Rap1A foi também avaliada com um ensaio de actividade específico. Observou-se que o mutante dominante negativo apresentava uma actividade igual ou superior à do constructo wt, enquanto o constitutivamente activo apresentava uma actividade igual ou inferior, o que levou a abandonar ambos estes mutantes. Estas discrepâncias em relação à literatura devem-se provavelmente à marcação com GFP. Em nenhuma destas experiências se observaram alterações na quantidade de CFTR total ou madura. O facto de não se ter observado um efeito pode ter sido devido à baixa eficiência de transfecção obtida, à baixa quantidade de proteína com o folding/processamento correctos ou devido a uma ausência de efeito. Finalmente, recorreu-se a câmaras de Ussing para analisar a função da CFTR em monocamadas polarizadas de células CFBE transfectadas com siRNA contra a Rap1A ou siRNA scrambled. Não se observaram diferenças na corrente transepitelial induzida pelo tratamento com forscolina (um composto que faz aumentar os níveis de AMP cíclico na célula, activando a CFTR) ou com genisteína (um potenciador específico da CFTR que maximiza a abertura do canal) em células tratadas com siRNA contra a Rap e tratadas com siRNA scrambled. Posteriormente, analisando por Western Blot a expressão de Rap1A nestas células, concluiu-se que a transfecção foi pouco eficiente, o que justifica a ausência de efeito. De uma forma geral, houve dois factores limitantes neste trabalho: o facto de, apesar de um longo processo de optimização, as eficiências de transfecção continuarem bastante modestas, e o facto de o sistema de expressão utilizado ser de difícil utilização. As observações mais significativas resultantes deste trabalho são: - Tanto em culturas primárias de células epiteliais humanas dos brônquios e em células CFBE41o- observa-se expressão endógena de Rap1A e Epac. - O padrão de expressão dos factores Epac em células CFBE altera-se quando as células são polarizadas. - Rap1A é expressa abundantemente nas junções célula-célula no epitélio respiratório, onde co-localiza com a E-caderina. - A Rap1A parece co-localizar com a CFTR em células do epitélio respiratório polarizadas. - A quantidade total de CFTR e a quantidade da forma madura (banda C) estão positivamente correlacionadas com os níveis de expressão endógena de Rap1A.

CFTR, the protein whose malfunction causes cystic fibrosis, is a chloride channel expressed in the apical membrane of epithelial cells. CFTR undergoes a long journey in the cell, since it is translated in association with the endoplasmic reticulum until its degradation, throughout which it interacts with numerous proteins. One of these was recently identified as Rap1A, a small GTPase that regulates cell-cell and cell-matrix adhesion, cell polarity and cytoskeleton dynamics. The aim of this work was to validate the interaction between CFTR and Rap1A and evaluate the impact of this small GTPase on CFTR biogenesis, trafficking and function. Rap1A expression was observed by Western blot in primary cultures of human bronchial epithelial cells and in the CFBE cell line. Plasmids encoding for several variants of GFP-tagged Rap1A were generated. Transfection with these or with siRNAs was optimized, although only sub-optimal efficiencies were achieved. Expression of Rap1A constructs was analysed by Western Blot, revealing a folding and/or processing defect for most constructs. Rap1A activity assays showed that the constitutively active mutant didn’t have higher activation levels than the wt construct, whereas the dominant negative had more activity than the wt construct, suggesting that the GFP-tagged constructs were not the most appropriate for this kind of study. No effects on CFTR were observed with Rap1A upregulation, possibly because of the low transfection efficiencies. Finally, CFTR function upon knockdown of Rap1A was analyzed in Ussing chambers. However, only a minor trend of decrease of CFTR function was observed for Rap1A siRNA transfected samples. Although suggestive of the need of a different experimental system, the results evidenced that: - Lung epithelial cells have endogenous expression of Rap1A. - The band pattern for Epac changed when CFBE cells were polarized; - Rap1A appears to be enriched in cell-cell junctions, where it co-localizes with Ecadherin; - Rap1A and CFTR seem to overlap; - There seems to be a positive correlation between Rap1A levels and both total CFTR expression and band C intensities.

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012

Document Type Master thesis
Language English
Advisor(s) Farinha, Carlos, 1973-
Contributor(s) Fernandes, João Miguel Parente
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