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Discovering and exploiting bacterial proteins as anticancer agents

Author(s): Silva, Gonçalo Emanuel Fialho Mourata da,1989-

Date: 2013

Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/9665

Origin: Repositório da Universidade de Lisboa

Subject(s): Cancro; Apoptose; Azurin; Teses de mestrado - 2013


Description

Azurin is a low molecular weight protein, produced by Pseudomonas aeruginosa and possesses several antitumor properties, like causing P-cadherin levels to decrease in invasive breast cancer cells. In this work, we studied the effect of lysosome and proteasome inhibitors on P-cadherin level, using a breast cancer cell line, expressing high P-cadherin level (MCF-7/AZ.Pcad), previously treated with azurin. Additionally, we evaluated how a cholesterol-depleting agent (MβCD) affects P-cadherin level. The effects of both inhibitors on P-cadherin were observed by western blot and confirmed that azurin mediates P-cadherin degradation through lysosome and proteasome proteolytic pathways. We also described, for the first time, that MβCD causes P-cadherin level to decrease. Together, these findings have increased our understanding of how the bacterial protein azurin is acting as anti-cancer agent. In this work we have also studied the in vitro cytotoxicity of two other bacterial proteins (MPT 63 and Ndk) against human breast and lung cancer cells. MPT 63 is an antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis that induces immunogenic responses in animal models and its cytotoxicity against several tumor cell lines was recently described in a patent. Nucleoside diphosphate kinase (Ndk) is a ubiquitous enzyme which maintains the nucleotide pools within the cells, and can be secreted by P. aeruginosa. A human Ndk, termed Nm23-H1, also showed an anti-metastatic role in different cancer models. In order to test possible antitumor properties of these proteins, MTT cell viability assays were performed in breast and lung cancer models (MCF-7/AZ.Mock and A549) using increasing azurin, MPT 63 and Ndk concentrations, and different exposure times. In addition, matrigel invasion assay was performed in A549 invasive cells treated with Ndk. Both azurin, MPT 63 and Ndk evidenced cytotoxicity against both cancer models in a time and dose dependent manner. Ndk revealed cytotoxic activity and selectivity against tumor cells similar to azurin. We observed a small decrease in cell invasion using this protein. In summary, we promoted a screening of new bacterial proteins that demonstrated antitumor potential, especially Ndk.

Novas terapias anti-tumorais emergentes baseiam-se em abordagens pouco convencionais, como a utilização de microorganismos, nomeadamente bactérias vivas ou produtos purificados a partir das mesmas, como proteínas. A azurina é uma proteína de baixo peso molecular, produzida por Pseudomonas aeruginosa e possui diversas propriedades anti-tumorais, entre as quais a indução de apoptose em células tumorais pela estabilização da proteína supressora de tumores p53. Mais recentemente, um novo tipo de acção anti-tumoral foi descoberta, tendo sida descrita a sua capacidade de diminuir os níveis de P-caderina em células tumorais invasivas de cancro da mama, sem afectar, no entanto, os níveis de E-caderina. O mecanismo, pelo qual a azurina causa o decréscimo de P-caderina nas células tumorais não é ainda totalmente conhecido, mas esta parece actuar a nível pós-transcripcional dado que não se verificam diferenças na expressão de P-caderina em células tratadas com azurina. Dados relativos a ensaios com análise a microarrays revelaram que a transcrição de genes associados ao lisossoma e processos de transporte mediado por vesículas se encontrava mais activa. No presente trabalho pretendeu-se esclarecer se a diminuição dos níveis de P-caderina, mediada pela acção da azurina, se deve à sua degradação pelos sistemas proteolíticos a nível celular, como o lisossoma e proteossoma. Nesse sentido utilizaram-se células de uma linha celular de cancro da mama, que expressa níveis elevados de P-caderina (MCF-7/AZ.Pcad), e que foram previamente tratadas com azurina antes de serem administrados inibidores de lisossoma (cloreto de amónio) e de proteossoma (MG-132). Do mesmo modo foram também avaliados os efeitos de um agente sequestrador de colesterol (MβCD) e inibidor de entrada da azurina nas células, ao nível da P-caderina nesta linha celular tumoral. Os efeitos de ambos os inibidores, ao nível da degradação da P-caderina, foram observados por western blot e confirmaram que a azurina medeia a degradação da P-caderina por sistemas proteolíticos como o lisossoma e o proteossoma. Descrevemos igualmente, pela primeira vez, que a MβCD provoca a diminuição dos níveis de P-caderina sem afectar os níveis de E-caderina. Conjuntamente, estes resultados permitiram aumentar o nosso conhecimento acerca do modo como a azurina actua como agente anticancerígeno neste caso específico. Neste trabalho pretendemos também estudar a citotoxicidade in vitro de duas outras proteínas bacterianas (MPT 63 e Ndk) em células tumorais humanas de cancro da mama e de pulmão. A MPT 63 é uma proteína antigénica secretada por Mycobacterium tuberculosis e capaz de induzir respostas imunogénicas em diversos modelos animais. Esta proteína apresenta uma estrutura semelhante a imunoglobulinas, uma característica que é partilhada com a azurina. Recentemente foi descrita como possuindo elevada actividade citotóxica contra várias linhas celulares tumorais, assim como um péptido derivado desta proteína (MB30), tendo esta propriedade de ambas as molécula sido registada numa patente. A nucleosídeo difosfato cinase (Ndk) é uma enzima ubíqua em diversos organismos e que tem como função manter as reservas de nucleótidos das células. Esta proteína pode igualmente ser secretada por várias bactérias como P. aeruginosa. As Ndks humanas estão agrupadas numa família de proteínas denominada de Nm23, tendo sidas até hoje descritas dez tipos. A primeira destas proteínas a ser descrita, denominada Nm23-H1, demonstrou possuir adicionalmente uma importante acção anti-metastática em diferentes modelos de cancro. Tendo em conta o vasto leque de acção anti-tumoral da azurina, procurou-se seleccionar duas proteínas bacterianas (MPT 63 e Ndk) com propriedades interessantes de serem exploradas, no sentido de testar uma possível actividade citotóxica das mesmas em células cancerígenas. Para esse efeito foram realizados ensaios de viabilidade celular (ou ensaios de MTT) em modelos tumorais de cancro da mama e do pulmão (MCF-7/AZ.Mock e A549), usando concentrações crescentes de azurina, MPT 63 e Ndk, bem como diferentes tempos de exposição, com o intuito de entender como estes parâmetros podem afectar o nível de citotoxicidade destas proteínas. Adicionalmente foi testada a actividade anti-metastática da Ndk, realizando um ensaio de invasão em matrigel, usando uma linha celular altamente invasiva de cancro de pulmão, A549. A azurina, assim como a MPT 63 e a Ndk, evidenciaram citotoxicidade contra ambos os modelos tumorais testados, de um modo dependente do tempo e concentrações administradas. A Ndk revelou níveis de actividade citotóxica e selectividade de acção, relativamente a células tumorais, semelhantes à azurina. Observámos ainda um pequeno decréscimo da invasão celular das células tumorais de pulmão A549, quando esta proteína foi administrada. Em suma, promovemos um rastreio de novas proteínas bacterianas que demonstraram potencial anti-tumoral, especialmente a Ndk. O conhecimento acerca destas propriedades necessita de ser expandido e aprofundado para que, no futuro, se possa avaliar a sua utilização como agentes anti-cancerígenos úteis, tal como a azurina.

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013

Document Type Master thesis
Language English
Advisor(s) Fialho, Arsénio M.; Crespo, Ana Maria Viegas, 1946-
Contributor(s) Silva, Gonçalo Emanuel Fialho Mourata da,1989-
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