Author(s): Barbacena, Pedro Miguel Branco, 1989-
Date: 2013
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/9881
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Biologia do desenvolvimento; Sistema nervoso central; Sinalização Notch; Neurobiologia molecular; Teses de mestrado - 2013
Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
During spinal cord development, Notch signalling regulates both the maintenance of progenitors and neuronal specification. In most spinal cord domains, a single Notch ligand is expressed however in the V2 domain two ligands (Dll1 and Dll4) are expressed. It is not known how Dll4 expression is regulated and how Dll4-mediated Notch signalling has a role in the specification of V2 interneurons (V2a, V2b and V2c) that are generated from V2 progenitors. To investigate how Dll4 expression is regulated, we have focused on three proneural bHLH genes (Mash1, Ngn1 and Ngn2), expressed in V2 progenitor cells. We characterized Dll4-expressing cells, by double RNA in-situ hybridization with each of the proneural genes. Our results revealed that Dll4+ cells can coexpress all three proneural genes but to different extents. Next, we have overexpressed each proneural gene (singly and in combination) in the chick neural tube, using in ovo electroporation. Embryos were tested in terms of: Dll4 expression and V2 cell-type specification. Although electroporation of either Mash1 or Ngn1 leads to downregulation of Dll4 expression in the V2 domain, only NGN1 is capable of inducing ectopic Dll4 expression. Moreover, both double electroporation of Mash1 and Ngn1, or Mash1 and Ngn2, represses Dll4 expression in the V2 domain, while leading to ectopic expression in other ventral spinal cord domains. Concerning cell-type specification, electroporation of Mash1 represses both V2a and V2b cell fate. Electroporation of either Ngn1 or Ngn2 increases the number of V2a INs, while repressing V2b INs. Double electroporation of Mash1/Ngn1, Mash1/Ngn2 or Ngn1/Ngn2 increases the number of V2a INs and represses V2b fate. Together, the results presented in this thesis show that MASH1 and NGN1 can repress Dll4 expression and that this repression correlates with alterations in V2 IN specification. Our results indicate that NGN2 can affect V2 specification, although it does not regulate Dll4 expression.
Um dos mais complexos sistemas biológicos é o Sistema Nervoso Central que é constituído por um elevado número e variedade de células, como neurónios e células da glia. Estas células são produzidas durante o desenvolvimento embrionário no momento e posição correctos de modo a interagirem entre si e formarem circuitos funcionais. Durante o desenvolvimento embrionário da espinal medula, vários interneurónios excitatórios e inibitórios são gerados, sendo o balanço entre eles estritamente regulado. No entanto os mecanismos moleculares subjacentes a esta diversidade celular ainda não são totalmente conhecidos. A via de sinalização Notch desempenha um papel essencial durante o desenvolvimento do Sistema Nervoso Central. Esta via de sinalização é um sistema de comunicação célula-a-célula, de contacto directo entre duas células vizinhas, através de duas proteínas membranares: o receptor Notch e os seus ligandos (Delta, Serrate ou Lag-2, dependendo do organismo). Sempre que um ligando de uma célula se liga ao receptor de outra célula, uma série de clivagens proteolíticas são desencadeadas, o que, em última instância, leva à libertação do domínio intracelular do receptor Notch (NICD). O NICD é translocado para o núcleo onde se associa ao CSL e ao Mastermind, activando a transcrição de genes alvo, como os genes HES. Na ausência de NICD, a proteína CSL actua como repressor transcricional dos mesmos genes. Uma das funções da via de sinalização Notch é a capacidade de manutenção de progenitores neurais, durante a neurogénese, impedindo uma diferenciação prematura massiva de todos os progenitores. A decisão de uma célula permanecer como progenitor, ou de se diferenciar, é controlada pelo balanço de dois tipos de factores de transcrição: as proteínas proneurais, que promovem a diferenciação; e as proteínas HES, que reprimem a diferenciação neural. Uma célula que, estocasticamente expresse elevados níveis de proteínas proneurais vai diferenciar-se. Normalmente as proteínas proneurais activam a expressão dos ligandos do Notch, o que leva a que esta célula expresse elevados níveis de ligandos, activando a via de sinalização Notch nas células vizinhas. Esta activação leva à expressão de elevados níveis de proteínas HES, sendo que estas células são mantidas como progenitores. Assim, a célula que expressa o ligando diferencia-se em neurónio mas simultaneamente assegura que as células vizinhas se mantenham como progenitores. Visto que a neurogénese ocorre durante uma larga janela temporal, a manutenção de uma população de progenitores permite que estas células sejam expostas a diferentes estímulos e, como tal, se diferenciem em diferentes neurónios durante o desenvolvimento, assegurando uma grande variedade celular ao nível do Sistema Nervoso Central. A espinal medula, ao longo do seu eixo dorso-ventral, pode ser dividida em onze domínios molecularmente distintos (seis deles dorsais e cinco ventrais). Estudos recentes mostram que a via de sinalização Notch está envolvida na especificação de células neurais, nomeadamente de interneurónios no domínio V2 da espinal medula. Neste domínio, três tipos de interneurónios diferentes: V2a, V2b e V2c, são gerados a partir de progenitores comuns. Na ausência da sinalização Notch, apenas os interneurónios V2a são gerados, o que significa que a sinalização Notch é necessária para a produção dos interneurónios V2b. Os interneurónios V2c foram recentemente identificados. Curiosamente, nesta fase do desenvolvimento, este é o único domínio onde se sabe que diferentes interneurónios são simultaneamente produzidos e o único domínio onde dois ligandos da via Notch são expressos: Dll1 e Dll4. Isto é uma excepção ao que ocorre em todos os outros domínios da espinal medula, onde apenas um ligando da via Notch é suficiente para regular a neurogénese. Possivelmente o ligando Dll1 está envolvido na activação da via Notch e consequentemente na manutenção de progenitores, enquanto o ligando Dll4 está envolvido na especificação dos interneurónios. Como é que a expressão de Dll4 é regulada no domínio V2 da espinal medula e como é que a especificação de interneurónios é controlada neste domínio são os principais temas investigados nesta tese. Os organismos modelo utilizados para estudar estas questões foram o embrião de ratinho e de galinha. Recorrendo à técnica de hibridação in-situ comecei por mapear a expressão de LFng (lunatic fringe) e Hes6 de modo a verificar de que modo a sinalização Notch via Dll1 ou Dll4 poderiam ser diferentes. Verifiquei que LFng é expresso em células que expressem Dll4 mas não em células que expressem Scl (marcador de V2b). Hes6 é expresso em células que expressem Dll1 ou Dll4 mas não em células Scl+, o que parece sugerir que, de facto, a sinalização Notch através destes dois ligandos é diferente. De modo a verificar como o Dll4 é regulado no domínio V2, foquei-me em três proteínas proneurais (MASH1, NGN1 e NGN2) que são expressas em progenitores do V2 e que, segundo abordagens bioinformáticas anteriores, são boas candidatas a regular a sua expressão. Primeiro foram caracterizadas as células que expressam Dll4 e cada um dos genes proneurais através de hibridações in-situ duplas. As células Dll4 podem co-expressar os três genes proneurais testados mas a diferentes níveis. Para testar se estas proteínas podem regular a expressão de Dll4, plasmídeos contendo os genes que codificam cada uma destas proteínas foram injectados (sozinhos ou em combinação) na espinal medula de embriões de galinha no estádio HH16-17 pela electroporação in ovo, de modo a sobre-expressar estas proteínas. Todos os embriões foram testados em termos de expressão de Dll4 e especificação de interneurónios. No que diz respeito à expressão de Dll4, a electroporação de Mash1 ou de Ngn1 leva a uma repressão de Dll4 no interior do domínio V2, mas apenas Ngn1 é capaz de induzir ectopicamente a expressão de Dll4. A sobreexpressão de NGN2, não altera a expressão endógena de Dll4, indicando que esta proteína proneural não será um factor importante no controlo da expressão deste gene. A electroporação dupla de Mash1 com Ngn1 ou de Mash1 com Ngn2 reprime também a expressão de Dll4 no domínio V2 mas leva à sua expressão ectópica noutros domínios ventrais da espinal medula. A sobreexpressão de NGN1 e NGN2 não parece afectar a expressão de Dll4 na espinal medula. Visto que as proteínas proneurais controlam a especificação de neurónios durante o desenvolvimento de Sistema Nervoso Central, foi analisado se a sobreexpressão destas proteínas afectaria o número de interneurónios V2a. Após a sobreexpressão de MASH1, uma diminuição no número de interneurónios V2a foi observada, indicando que esta reprime, directa ou indirectamente, a produção destes interneurónios. Contrariamente e após a sobreexpressão de NGN1 ou NGN2, o número de interneurónios V2a aumenta, o que sugere que estas proteínas promovem directamente a diferenciação de interneurónios V2a. A sobreexpressão em diferentes combinações também leva a um aumento de interneurónios V2a no domínio V2. Foi ainda analisado se o número de progenitores de V2a através da análise de BHLHB5 e LIM3. Verifiquei que MASH1 e NGN1 reprimem o número destes progenitores enquanto Ngn2 não os afecta. Por hibridação in situ foi verificado se o número de interneurónios V2b também seria afectado e verifiquei que em todas as condições o número de V2b sofre uma diminuição, indicando que todas as proteínas proneurais reprimem, directa ou indirectamente a produção destes interneurónios. Além disto foi analisado o que acontecia à especificação DV da espinal medula aquando da sobreexpressão das proteínas proneurais. Para isso foi analisado o domínio MN que mantem interacções antagónicas com o domínio V2, através da expressão de OLIG2. Verificou-se que o número de células OLIG2+ aumentou quando MASH1 é o sobre-expressa ou quando as combinações de proneurais são sobre-expressas. Assim verificou-sei que MASH1 e NGN1 regulam a expressão de Dll4 e, consequentemente a especificação de interneurónios enquanto NGN2 não parece regular a expressão de Dll4, afectando apenas a especificação de interneurónios. Este estudo apresenta novas evidências sobre a função que diferentes proteínas proneurais têm na regulação da expressão de Dll4 e na especificação de interneurónios no domínio V2.
