Author(s):
Rodrigues, Célia Fortuna
Date: 2018
Persistent ID: http://hdl.handle.net/1822/55984
Origin: RepositóriUM - Universidade do Minho
Project/scholarship:
info:eu-repo/grantAgreement/FCT/5876-PPCDTI/119069/PT
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Subject(s): Candida glabrata; biofilm; matrix; antifungal; resistance; biofilme; matriz; antifúngico; resistência
Description
Doctoral dissertation for PhD degree in Chemical and Biological Engineering
Candidiasis are the most common fungal diseases, especially among immunosuppressed, hospitalized and patients with prolonged contact to medical devices. Generally, Candida albicans is the most encountered Candida spp., however, in the last decades, non-Candida albicans Candida (NCAC) spp. have been increasing their responsibility in the cases of candidiasis. In this group, one of the most important species is Candida glabrata. This species presents azole resistance, like Candida krusei and a quick capacity to develop resistance to echinocandins, similar to Candida parapsilosis. Although not having capacity to produce certain important enzymes (e.g. hydrolases), C. glabrata has an essential feature that explains part of its recalcitrance to antifungals: the capacity to form biofilms. The present thesis has the general purpose of increasing the current knowledge on the different and less explored biofilms of C. glabrata, their mechanisms of resistance to antifungal drugs, and ultimately contributing to the path into a more consistent optimization and patient response to the present therapies. Thus, to begin, a method to study the fluconazole's diffusion through the biofilm matrices was developed and then the effectiveness of voriconazole in C. glabrata biofilms was determined. It was concluded that voriconazole had higher activity than fluconazole and its diffusion was also deeper. Some changes were noticed in the ERG3, ERG6 and ERG11 genes expression. Additionally, an association of ascorbic acid (immunostimulator and β-glucan degradator) and fluconazole was applied to biofilms of C. glabrata. Biofilms C. glabrata were weakened, but not entirely degraded, and the number of cells was higher, due to the assimilation of the glucose derived from the β- glucan hydrolysis. In the context of polyenes, it was assessed the capacity of C. glabrata to form biofilms in the presence of clinical concentrations of amphotericin B. This capacity was confirmed, demonstrating the resistance of this species, even when using drugs with a good antifungal activity. In another approach, the comparison between two amphotericin B formulations – deoxycholate and liposomal – was performed in C. glabrata biofilms, and other Candida spp.. Both formulations have a good biomass reduction capacity, but the liposomal has a better activity against biofilm cells. The concomitant use of a polyene and an azole was showed to be mostly antagonist, since when applying amphotericin B and posaconazole, the effect in the number of cells, biomass reduction and Fractional inhibitory concentration index (FICI) calculation was not better than using each drug alone. Caspofungin and micafungin showed to induce great changes in C. glabrata biofilm matrices. These echinocandins were evaluated in terms of planktonic and biofilm cell susceptibility, showing to be better in the first case than in the latter. The biomass reduction was very good in both cases, but the variations regarding the quantity of proteins were variable. The amount of β-glucans generally decreased after the echinocandins’ contact, in opposition with the other drug’s response. Regarding transcriptomics, firstly a set of genes responsible for the production of matrix components was selected and their expression was assessed, on C. glabrata biofilm cells. In a general manner, all genes were overexpressed, but the ones related to the production of β-1,3- glucans revealed a higher expression. It was concluded that the cells invest more in the replacement of these biopolymers than the others and that they might have a greater impact in the biofilm cells lower susceptibility to antifungal drugs. Next, a C. glabrata mutant knocked-out on the MNN2 gene was studied in the biofilm form. The biofilm cells were evaluated in terms of drug susceptibility, cell wall, and the biofilm composition was also determined. There were no visible differences among the cell walls of the strains, but the mutant showed to have a great biomass reduction, after a drug stress. The quantity of mannans of the biofilm cells in the mutant decreased. The biofilm cell walls composition showed an increase of the quantity of β-1,3-glucans in the C. glabrata Dmnn2, when compared to the reference strain, possibly compensating the reduction of mannans. This increase in β-1,3-glucans could explain the reduction in the biofilm susceptibility. The in vivo approach permitted an exploration on the drug and immune response of an infection related solely to biofilm cells of C. glabrata and then treated with two echinocandins. The results showed that, generally, the immune response in C. glabrata is very distinctive from C. albicans. The fungal burden was higher in the liver than in the kidneys. Neither caspofungin nor micafungin was effective in fully eradicating C. glabrata biofilm cells and it was noticed a predominant mononuclear immune response in the spleen, liver and kidneys of the infected mice. In summary, the present thesis compiles important data that increase the knowledge on the mechanisms of antifungal resistance of C. glabrata biofilms, contributing to the path into a more sustained and defined understanding on how the biofilm matrices and the biofilm cells contribute to more severe infections. Moreover, it is underlined the importance on how these biofilm-derivedinfections need to be addressed differently from the the planktonic ones, replacing the current protocols.
A candidíase é a patologia fúngica mais comum, especialmente em indivíduos imunossuprimidos, hospitalizados e em doentes que necessitam de ser sujeitos a dispositivos médicos durante longos períodos de tempo. Geralmente a Candida albicans é a espécie mais identificada, no entanto, nas últimas décadas, a prevalência de espécies de Candida não albicans sofreu um aumento significativo. Neste grupo, uma das espécies mais importantes é a Candida glabrata. Esta espécie possui uma resistência inata aos azóis e uma rápida habilidade de desenvolver resistência às equinocandinas. Embora a C. glabrata não tenha capacidade para produzir certas enzimas consideradas fatores de virulência importantes (por exemplo, hidrolases), ela possui uma característica essencial que explica parte da sua resistência aos fármacos antifúngicos: a capacidade de formar biofilmes. A presente dissertação tem como objetivo geral ampliar o conhecimento atual sobre os diferentes, e menos explorados, biofilmes de C. glabrata, os seus mecanismos de resistência a fármacos antifúngicos e, por fim, contribuir para uma otimização da resposta do doente relativamente às atuais terapêuticas. Assim, começou-se por desenvolver um método que permitiu estudar a capacidade de difusão do fluconazol em matrizes de biofilmes de C. glabrata e, seguidamente, determinou-se a eficácia do voriconazol nestes biofilmes. Concluiu-se que a atividade deste fármaco era maior que a do fluconazol e sua difusão também era maior. Algumas mudanças na expressão dos genes ERG3, ERG6 e ERG11 também foram observadas. De seguida, uma associação de ácido ascórbico (imunoestimulador e degradador de β-glucanos) e fluconazol foi aplicada em biofilmes de C. glabrata, que foram enfraquecidos, mas não totalmente degradados. Verificou-se um aumento do número de células talvez devido à assimilação da glicose derivada da hidrólise do β-glucano. Foi também avaliada a capacidade de C. glabrata em formar biofilmes em presença de concentrações clínicas de anfotericina B (anf B). Esta capacidade foi confirmada, demonstrando a resistência desta espécie, mesmo usando fármacos com boa atividade antifúngica. A comparação entre duas formulações de anf B - desoxicolato e lipossomal - em biofilmes de C. glabrata mostrou que ambas as formulações têm uma boa capacidade de redução de biomassa, mas a lipossómica exibiu uma melhor atividade contra células de biofilme. O uso concomitante de um polieno e de um azole revelou-se sobretudo antagonista, pois ao aplicar anf. B e posaconazole, o efeito na contagem de células, na redução da biomassa e no cálculo do índice fracionário de concentração inibitória não foi melhor do que usar cada fármaco isoladamente. A caspofungina e a micafungina induziram grandes mudanças na composição bioquímica nas matrizes de biofilme de C. glabrata. Estas equinocandinas foram avaliadas em termos de susceptibilidade a células planctónicas e de biofilmes, mostrando-se melhor no primeiro caso do que no segundo. A redução da biomassa foi muito boa em ambos os casos, mas as variações quanto à quantidade de proteínas foram inconstantes. A quantidade de β-glucanos geralmente diminuiu após o contato das equinocandinas, em oposição à resposta de outros fármacos de classes diferentes. Foi, depois, selecionado um conjunto de genes responsáveis pela produção de componentes da matriz e foi avaliada a sua expressão, nas células de biofilme de C. glabrata. De forma geral, todos os genes foram sobreexpressos, mas os relacionados com a produção de β-1,3-glucanos tiveram uma expressão mais elevada. Concluiu-se que as células investem mais na substituição desses biopolímeros do que na dos demais, podendo ter um maior impacto nas células de biofilme, induzindo uma menor susceptibilidade a fármacos antifúngicos. Para completar este estudo avaliou-se a capacidade de formação de biofilme de um mutante de C. glabrata sem o gene MNN2. Não se detetaram diferenças visíveis entre as paredes celulares das estirpes, mas o mutante apresentou uma grande redução de biomassa, após o stress provocado pelos fármacos. A quantidade de mananos das células do biofilme no mutante diminuiu e a composição das paredes celulares do biofilme mostrou um aumento da quantidade de β-1,3-glucanos na C. glabrata Dmnn2, possivelmente compensando a redução de mananos. Este aumento nos β-1,3-glucanos poderá explicar a redução da susceptibilidade do biofilme aos fármacos. O ensaio in vivo permitiu estudar a resposta imune e das equinocandinas, relativamente a uma infeção de C. glabrata originada exclusivamente com células de biofilme. Os resultados mostraram que a resposta imune em C. glabrata é muito distinta da de C. albicans. A carga fúngica foi maior no fígado do que nos rins e nem a caspofungina nem a micafungina foram efetivas na erradicação total das células de biofilme de C. glabrata. Em resumo, a presente dissertação compila dados importantes que acrescentam conhecimento sobre os mecanismos de resistência antifúngica aos biofilmes de C. glabrata, contribuindo para uma compreensão mais sustentada e definida sobre como as células e as matrizes de biofilmes contribuem para infeções mais graves de C. glabrata. Além disso, sublinha a importância das infeções derivadas do biofilme, que deveriam ser abordadas de maneira diferente das planctónicas, sendo importante ajustar os protocolos atuais de terapêutica.
This work was supported by the Programa Operacional, Fatores de competitividade – COMPETE and by national funds through FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia under the scope of the following projects: FCT PTDC/SAU-MIC/119069/2010, RECI/EBB-EBI/0179/2012, PEst- OE/EQB/LA0023/2013, UID/BIO/04469/2013 unit, COMPETE 2020 (POCI-01-0145-FEDER- 006684), BioTecNorte operation (NORTE-01-0145-FEDER-000004) funded by the European Regional Development Fund under the scope of Norte2020 - Programa Operacional Regional do Norte and Célia F. Rodrigues’ SFRH/BD/93078/2013 PhD grant. The authors also thank the Project “BioHealth - Biotechnology and Bioengineering approaches to improve health quality", Ref. NORTE-07-0124-FEDER-000027, co-funded by the Programa Operacional Regional do Norte (ON.2 – O Novo Norte), QREN, FEDER.
