Estudo da tolerância de Rhizobium leguminosarum bv. viciae ao cádmio

• Author(s): Pereira, Sofia Isabel Almeida
• Date: 2004
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10773/16726
• Origin: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
• Subject(s): Toxicologia; Poluição ambiental; Metais pesados
• Document Type: Master thesis
• Language: Portuguese

Description

A contaminação do meio ambiente por metais pesados é muito comum, e pode resultar de uma variedade de fontes antropogénicas, entre as quais indústrias metalúrgicas, descargas de efluentes, fundições, minas e aplicação pesticidas e fertilizantes contaminados. A quantidade de metais acumulada no solo, resultante da poluição ambiental, depende da escala de emissão, do transporte do metal a partir da fonte e também da retenção do metal no solo. Os microrganismos do solo são sensíveis a exposições prolongadas a metais pesados. Assim, neste trabalho pretendeu-se isolar Rhizobium de diferentes locais que sofreram contaminação por metais pesados durante longos anos, por forma a determinar a sua tolerância ao cádmio em meio artificial suplementado com diferentes concentrações de CdCl2. Além disso, determinaram-se alguns parâmetros físico-químicos que influenciam a biodisponibilidade dos metais e as concentrações destes elementos nos solos. A variabilidade de tolerâncias verificada entre os isolados de Rhizobium sugere que por detrás da maquinaria metabólica básica, existem outros mecanismos que permitem os isolados mostrarem diferentes respostas ao stresse provocado pelo cádmio. Este facto levou-nos a aprofundar algumas características macromoleculares dos isolados com o objectivo de identificar mecanismos de tolerância e/ou características intrínsecas dos próprios isolados que lhes possam conferir essa tolerância ao metal. De acordo com os resultados obtidos podemos dizer que VE e AS foram os locais que apresentaram concentrações mais elevadas de metais, sendo por isso os mais contaminados. A concentração máxima permitida por lei para o Zn foi largamente ultrapassada em VE, e em AS a concentração verificada esteve muito próxima do limite máximo permitido. Os resultados obtidos evidenciaram que a tolerância dos isolados de Rhizobium foi diferente entre os isolados estudados. De acordo com a CMT os isolados podem ser divididos em 4 categorias: os sensíveis (0-125 μmol.l-1 CdCl2), os medianamente tolerantes (125 e 210 μmol.l-1 CdCl2), os tolerantes (250 e 500 μmol.l-1 CdCl2) e os extremamente tolerantes que toleraram concentrações ≥ 750 μmol.l-1 de cádmio. Os isolados de BTA foram os mais tolerantes uma vez que 46,7% destes toleraram concentrações entre 250 e 500 μmol.l-1 de cádmio, seguindo-se os isolados de AS e SB. No entanto, para concentrações ≥ 750 μmol.l-1, esta tendência apenas foi verificada para BTA. Os isolados de BTB são na sua maioria medianamente tolerantes (70%), enquanto que os isolados de MA são medianamente tolerantes e tolerantes, ao contrário dos isolados de MB que são todos sensíveis. Os perfis polipeptídicos dos isolados de Rhizobium foram bastante diferentes entre si, evidenciando uma grande variabilidade entre os isolados estudados. A presença de cádmio induziu o aumento/diminuição de alguns polipeptídeos, sugerindo uma adaptação das células às condições de stresse. Na sua maioria, as alterações provocadas pelo cádmio corresponderam a diminuições da expressão proteica, sugerindo que o metal afecta o metabolismo básico das células, inibindo passos metabólicos importantes para a sobrevivência e crescimento do rizóbio. vi Os isolados de Rhizobium estudados também apresentaram diferentes perfis plasmídicos. A maioria dos isolados tolerantes apresentaram 2 plasmídeos de pesos moleculares iguais a 485 e 415 kb, sugerindo que a tolerância destes isolados está relacionada com a presença de plasmídeos. Todos os isolados estudados apresentaram concentrações de cádmio intracelular significativamente inferiores ao cádmio adsorvido à parede. Nos isolados sensíveis, medianamente tolerantes e tolerantes a quantidade de cádmio adsorvida foi em muitos casos 100 vezes superior à verificada no interior da célula. Estes resultados sugerem a existência de mecanismos de exclusão ou sequestração extracelular do metal nos isolados medianamente tolerantes e tolerantes. Nos isolados extremamente tolerantes, a quantidade de cádmio adsorvida à parede foi em média 15 vezes superior à concentração de cádmio intracelular, isto significa que muito provavelmente existem mecanismos de sequestração intracelular. Em suma, podemos concluir que a resposta destas bactérias ao stresse provocado pelo cádmio é um fenómeno complexo, estando a tolerância de Rhizobium dependente de vários mecanismos que se desencadeiam paralelamente. Com efeito, parece evidente a existência de um mecanismo de tolerância comum a todos os isolados, que se caracteriza pela presença e/ou indução do aumento de LPS que contribuem para a sequestração extracelular dos metais. Contudo, apesar dos LPS conferirem um certo grau de tolerância, estes não são suficientes para suportar níveis mais elevados de stresse. Assim, a presença de outros mecanismos é essencial. De facto, nos isolados tolerantes a existência de 2 plasmídeos (485 e 415 kb) indica-nos um possível envolvimento destes na tolerância ao cádmio. Por outro lado, nos isolados extremamente tolerantes, podemos inferir que a tolerância se deve à presença de agentes intracelulares que impedem o metal de interferir com os processos metabólicos mais importantes. Os isolados tiveram diferentes origens e estiveram sujeitos a diferentes tipos de contaminação, no entanto estes factores não influenciaram os mecanismos de tolerância ao cádmio.

Environment heavy metals contamination is now widespread. Soils may become contaminated from a variety of anthropogenic sources such as smelters, mining, industry and application of metal-containing pesticides and fertilizers. The amounts of cadmium accumulated in soils from environmental pollution will depend on the scale of emission, the transport of the metal from the source to the site and the retention of the metal once it has reached the soil. The soil microorganisms are very sensitive to long exposures to moderate heavy metal concentrations. Therefore, the present work aimed to isolate Rhizobium from different locations, which have suffered heavy metal contamination since years ago, in order to determine cadmium tolerance in artificial media supplemented with different concentrations of CdCl2. Furthermore, we have determined some physic-chemical parameters that influence the availability of metals, and also their concentrations in soil. The heavy metal tolerance variability among Rhizobium isolates suggests that beyond basic metabolic machinery there also exist variations that allow isolates to display distinct tolerance responses to cadmium stress. This fact, leads us to investigate some macromolecular characteristics from isolates in order to identify tolerance mechanisms and/or intrinsically characteristics that permit isolates to enhance tolerance. In agreement with results we can say that VE and AS presented the highest concentrations of metals, and are therefore the most polluted soils. The maximum permissible concentration to zinc was largely overcome in VE, and in AS the registered concentration was near the limit. Our results showed different tolerances among Rhizobium isolates, according CMT, the isolates can be divided in 4 groups: sensitive (0-125 μmol.l-1 CdCl2); moderately tolerant (125 –210 μmol.l-1 CdCl2); tolerant (250-500 μmol.l-1 CdCl2); and extremely tolerant (≥ 750 μmol.l-1 CdCl2). BTA isolates were the most tolerant ones since 46,7 % of them tolerated concentrations between 250 e 500 μmol.l-1 of CdCl2, followed by AS and SB isolates. However, in concentrations up to 750 μmol.l-1 this tendency was only checked to BTA. The isolates from BTB are mainly moderately tolerant (70%), while MA isolates are moderately tolerant and tolerant, unlike MB isolates that are all sensitive. The electrophoretic patterns of whole-cell soluble proteins of Rhizobium isolates were very distinct, showing high variability between them. Cadmium induced increases/decreases of some polypeptides, which indicates an attempt of cells to adjust to the new adverse conditions. Most of the alterations corresponded to decreases in protein expression, suggesting a deleterious effect on basic cell metabolism, which imposed an inhibition of important metabolic pathways hence inhibiting survival and development of Rhizobium. The studied Rhizobium isolates also presented different plasmid profiles. Most tolerant isolates presented 2 plasmids with molecular weights of 485 and 415 kb, suggesting the possible involvement of these plasmids in cadmium tolerance. All isolates presented smaller quantities of cadmium inside the cell when compared with concentrations adsorbed to cell wall. viii In sensitive, moderately and tolerant isolates the quantity of metal adsorbed was, in many cases 100 times higher than inside cell. These results suggest the existence of exclusion mechanisms or extracelular sequestration of metal in moderately tolerant and tolerant isolates. In extremely tolerant isolates, the amount of cadmium adsorbed to cell wall was, on average, 15 times higher than cadmium absorbed, which probably means that exists intracellular sequestration mechanisms. In summary, we can conclude that the response of these bacteria to cadmium stress is a complex phenomenon, and the tolerance of Rhizobium is dependent of a variety of mechanisms, which unchained parallel. It seems that there is a common tolerance mechanism to all isolates, which is characterized by the presence and /or induction of LPS. These molecules contribute to extracelular sequestration of metals. However, even though LPS conferred a degree of tolerance, they are not sufficient to support higher stress. Thus, the presence of others mechanisms are essential. In fact, in tolerant isolates, smaller quantity of cadmium intracellular and the existence of 2 plasmids (485 and 415 kb), indicated the possible involvement of these plasmids in cadmium tolerance. On the other hand, in extremely tolerant isolates, we can assume tolerance is related with the presence of intracellular agents that prevent metal to interfere with the most metabolic processes. Even though isolates were originated from different locations and had been exposed to different kinds of heavy metal contamination the tolerance mechanisms were not influenced.