Author(s): Henriques, Isabel
Date: 2001
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10773/4398
Origin: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
Subject(s): Microbiologia molecular - Teses de mestrado; Agentes antimicrobianos; Antibióticos; Bactérias; Genética
A estirpe Serratia fonticola UTAD54 foi isolada no âmbito de um estudo realizado com o objectivo de analisar a presença e disseminação de genes de resistência a antibióticos, em bactérias de águas de consumo. Verificou-se que esta estirpe é resistente a diversos antibióticos do grupo dos beta-lactâmicos, nomeadamente às penicilinas e aos carbapenemos. No âmbito deste estudo foi detectada a produção de uma metalo-beta-lactamase denominada SfhI, responsável pelo fenótipo de resistência aos carbapenemos (Saavedra, 2000). O objectivo principal do presente trabalho é caracterizar os mecanismos responsáveis pela resistência às penicilinas na estirpe S. fonticola UTAD54. Um clone resistente à carbenicilina foi seleccionado a partir de uma biblioteca genómica desta estirpe. O DNA plasmídico recombinante foi extraído e analisado, e a sequência nucleotídica de um fragmento com cerca de 1,7 Kb foi determinada. A análise desta sequência permitiu detectar a presença de uma ORF constituída por 927 nucleótidos que codifica um péptido com cerca de 30,7 KDa. O valor do ponto isoeléctrico desta proteína foi estimado em 7,95. A sequência de aminoácidos deduzida revelou um elevado grau de homologia com as sequências das 5 carbapenemases de classe A conhecidas, nomeadamente KPC-1 (66 %), NMC-A (59 %), IMI-1 (59 %), Sme-1 (59 %) e Sme-2 (60 %). A similaridade entre estas enzimas e a enzima SFC-A foi confirmada pela elaboração de alinhamentos múltiplos das sequências de aminoácidos e pela construção de uma árvore filogenética. Os motivos conservados característicos das beta-lactamases de classe A, incluindo o motivo SXXK no local activo, foram identificados na sequência aminoacídica da enzima SFC-A. No terminal amínico foi identificado um péptido sinal, provavelmente envolvido no transporte da proteína para o espaço periplásmico. A montante dos genes que codificam as carbapenemases de classe A foi detectado um gene que codifica para uma proteína reguladora. No caso do gene sfcA as experiências realizadas não permitiram confirmar a presença de um gene homólogo em termos funcionais. O fenótipo de resistência conferido pela enzima SFC-A quando expressa em E. coli inclui o imipenemo, a carbenicilina, a amoxicilina, a piperacilina, a cefalotina, e o aztreonamo. Por outro lado verifica-se que a actividade hidrolítica desta enzima é inibida pelo ácido clavulânico e pelo tazobactam. Este perfil de substratos e inibidores é semelhante ao descrito para as carbapenemases de classe A previamente caracterizadas. A enzima SFC-A é a sexta carbapenemase de classe A caracterizada até ao momento. É a primeira vez que uma beta-lactamase com estas características é identificada num isolado ambiental. Por outro lado, trata-se da primeira vez que é detectada a produção de uma metalo-beta-lactamase e de uma carbapenemase de classe A pela mesma estirpe bacteriana. Finalmente, utilizaram-se métodos estabelecidos de tipagem genética com o objectivo de proceder a uma caracterização molecular preliminar da estirpe S. fonticola UTAD54. Pretendeu-se, essencialmente, optimizar as condições a utilizar em estudos posteriores. Os resultados obtidos permitiram verificar que as técnicas de PFGE e ribotipagem são adequadas aos objectivos propostos devido à sua elevada reprodutibilidade e ao seu poder discriminatório.
In previously reported experiments, accessing the presence and dissemination of resistance genetic determinants in drinking water bacteria, a carbapenem resistant Serratia fonticola strain was isolated. This strain, designated S. fonticola UTAD54, was also resistant to penicillins. Those studies reported that S. fonticola UTAD54 produces a metallo-beta-lactamase named SfhI, responsible for the carbapenem resistance phenotype observed (Saavedra, 2000). The work here described intends to characterize the mechanisms responsible for the penicillin resistance phenotype. A carbenicillin resistant E. coli transformant was obtained from a S. fonticola UTAD54 genomic library and the correspondent recombinant plasmid DNA extracted and analysed. The nucleotidic sequence of a 1,7 Kb fragment was determined and the presence of a beta-lactamase gene (named sfcA) confirmed. The ORF includes 927 nucleotides and encodes a 30,7 KDa protein (SFC-A), with an estimate pI of 7,95. The deduced amino acid sequence shows a high degree of homology with the 5 known carbapenem-hydrolyzing class A beta-lactamases, namely KPC-1 (66 %), NMC-A (59 %), IMI-1 (59 %), Sme-1 (59 %) and Sme-2 (60 %). This similarity was confirmed by multiple sequence alignment studies and by the construction of a phylogenetic tree. The conserved sequences characteristic of class A beta-lactamases, including the SXXK motif in the active site, were all identified in the amino acid sequence of SFC-A. A signal peptide was identified consistent with a probable periplasmic location of this protein. It was not possible to confirm the presence of a regulatory protein gene upstream of sfcA, similar to that reported to the class A carbapenemases. The resistance phenotype conferred by SFC-A includes imipenem, carbenicillin, amoxicillin, piperacillin, cephalotin, and aztreonam and its activity is inhibited by clavulanic acid and tazobactam. Those results are similar to that reported for the previously described class A carbapenemases. The enzyme SFC-A, here described, is the 6ª class A carbapenemase characterized until now. To our knowledge it is the first time that such an enzyme is identified in an environmental isolate. Aditionally this is the first report of a strain producing a metalo-beta-lactamase and a class A carbapenemase. Finally, molecular typing methods were used in order to obtain a preliminary molecular characterization of the strain S. fonticola UTAD54. An optimisation of the conditions used was accessed. The results obtained revealed that PFGE and ribotyping techniques are very useful for the mentioned proposes due to their reproducibility and discriminatory power.
