Characterization of the PP1 interactome from human testis

• Author(s): Fardilha, Margarida Sâncio da Cruz
• Date: 2003
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10773/4490
• Origin: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
• Subject(s): Citologia - Teses de doutoramento; Sistema reprodutor masculino
• Document Type: Doctoral thesis
• Language: English

Description

Protein phosphorylation is a major regulatory mechanism notably of signal transduction cascades in eukaryotic cells. Protein phosphorylation is catalysed by protein kinases and can be reversed by the action of protein phosphatases. Although phosphatases were discovered more than sixty years ago, their importance as central players in multiple cellular mechanisms was only recently recognized. PP1, a Serine/Threonine specific phosphatase, is involved in important cellular mechanisms such as the cell cycle, muscle contraction and apoptosis, among others. Its role in such diverse cellular processes depends on its interactions with targeting/regulatory subunits. To date, more than 50 regulatory subunits have been identified that bind the catalytic subunit of PP1 determining its function in a specific cellular location. Several isoforms of PP1 are known, termed PP1 , PP1 and PP1 . The gamma isoform undergoes alternative splicing to yield a ubiquitously expressed PP1 1 and a testis-specific PP1 2 isoform. Incubation of non-motile immature sperm with phosphatase inhibitors induces sperm motility, and PP1 2 was implicated in this process. This led us to search for PP1 2-specific interactors in human sperm that could be targeted for infertility therapeutics or in male contraception. To achieve this goal the Yeast Two Hybrid system was used to screen a human testis library for new PP1 binding proteins using both PP1 1 (YTH1) and PP1 2 (YTH2) as baits. We recovered 120 positive clones in YTH1 and 155 positive clones in YTH2. Among these were clones encoding “bona fide” PP1 interactors such as Nek2 and NIPP1, and also previously uncharacterized proteins. We undertook a more detailed study of a novel gene encoding a novel protein that we termed SEARP-T. This protein of 93KDa is expressed mainly in testis and fluorescence immunocytochemistry was used to determine its intra sperm localization. Both PP1 2 and SEARP-T proteins are present in the tail and in the equatorial segment of the head.These results provide new insights into PP1 function in human testis and sperm motility, and indicates that the Yeast Two Hybrid System provides a mean to understand the roles PP1 plays in diverse cellular regulatory events.

A fosforilação de proteínas é um dos principais mecanismos reguladores de cascatas de transdução de sinais em eucariotas. A fosforilação é catalizada por proteínas cinases e é revertida pela acção de proteínas fosfatases. Embora as proteínas fosfatases tenham sido descobertas à mais de sessenta anos, a sua importância central em múltiplos mecanismos celulares só muito recentemente foi reconhecida. PP1, uma fosfatase específica para serina/treonina, está envolvida em importantes mecanismos celulares, como o ciclo celular, a contracção muscular e a apoptose, entre outros. O seu papel em tão variados processos celulares depende das suas interacções com subunidades reguladoras. Até à data, foram descritas mais de 50 subunidades reguladoras que se ligam à subunidade catalítica da PP1, sendo determinantes para a sua função num local específico da célula. Das três isoformas da PP1 conhecidas, PP1 , PP1 e PP1 , a isoforma gama sofre splicing alternativo, originando a PP1 1, ubíqua e, a PP1 2 específica de testículo. Incubação de espermatozóides imaturos com inibidores de fosfatases induz a sua motilidade, sendo a PP1 2 a fosfatase envolvida. Este facto levou-nos a procurar proteínas de testículo humano capazes de interagir especificamente com a PP1 2 que possam ser alvos terapêuticos no tratamento da infertilidade, ou na contracepção masculina. Para atingir este objectivo utilizou-se o sistema Dois Híbrido de Levedura no rastreio de uma biblioteca de testículo humano, na busca de novas proteínas que se ligam à PP1 usando como isco a PP1 1 (no YTH1) ou a PP1 2 (no YTH2). Obtivemos 120 clones positivos no YTH1 e 155 no YTH2. Entre eles encontravam-se clones que codificam reguladores da PP1 previamente descritos, como a Nek2 e a NIPP1, assim como novas proteínas. Efectuámos um estudo detalhado de um novo gene, codificando uma nova proteína, que denominamos SEARP-T. Esta proteína de 93kDa é expressa maioritariamente em testículo e, a sua localização intracelular foi determinada por imunocitoquímica de fluorescência. Ambas as proteínas, PP1 2 e SEARP-T, estão presentes na cauda e no segmento equatorial da cabeça do espermatozóide. Estes resultados clarificam as funções da PP1 no testículo humano e na motilidade do esperma e, indicam que o sistema Dois Híbrido de Levedura é um bom método para compreender o papel da PP1 em múltiplos eventos de regulação celular.