Clonagem e caracterização do gene de sintetase da quitina em Botryosphaeria spp.

• Author(s): Oliveira, Catarina da Silva
• Date: 2008
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10773/819
• Origin: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
• Subject(s): Microbiologia; Quitina; Genética vegetal; Clonagem
• Document Type: Master thesis
• Language: Portuguese

Description

Botryosphaeria é um género bem conhecido devido às espécies que causam doenças numa grande diversidade de plantas economicamente importantes. Este género é actualmente composto de duas espécies, Botryosphaeria dothidea e Botryosphaeria corticis. A parede celular é essencial à sobrevivência dos fungos, fornecendo protecção contra danos mecânicos e resistência à pressão interna. Dada à sua importância vital e natureza química, é alvo para acção de drogas antifúngicas. Como em todos os fungos, a quitina também faz parte da constituição da parede celular do género em estudo, sendo um polímero estrutural importante para a manutenção da forma e rigidez da parede, bem como na formação de septos. Vários genes que codificam diferentes isoformas de sintetases da quitina fúngicas foram já clonados e caracterizados. A partir de DNA genómico de B. dothidea CBS115476 e B. corticis CBS119047 foram amplificados, por PCR, fragmentos de genes de sintetase da quitina os quais foram, posteriormente, clonados e sequenciados. A análise das sequências nucleotídicas e sequências de aminoácidos deduzidas dos 17 clones revelou a existência de três classes distintas de CHS (I, II e III). A análise filogenética dessas sequências permitiu estabelecer algumas relações filogenéticas entre espécies de Botryosphaeria e outros fungos registados no GenBank. Em todas as análises filogenéticas verificou-se que as duas espécies de Botryosphaeria agrupam num ramo distinto. A análise de sequências de CHS de classe II e III permitiu ainda uma distinção entre as espécies B. dothidea e B. corticis, revelando potencial como marcadores filogenéticos ao nível da espécie. As sequências de CHS classe I não permitiram uma distinção clara entre ambas as espécies. Por hibridação pretendeu-se detectar fragmentos homólogos ao gene de sintetase da quitina em quatro estirpes de Botryosphaeria, sendo as sondas 3 clones sequenciados anteriormente, cada um pertencente a uma classe de sintetase da quitina (I, II e III). Após hibridação, foram detectados fragmentos HindIII em todas as estirpes testadas, para as três classes de sondas. Tal facto indica a presença de sequências homólogas do gene que codifica para a sintetase da quitina nos genomas das quatro estirpes. A detecção de um só fragmento por cada uma das classes sugere que estes genes são de cópia única. No entanto, a sequenciação de diversos clones revelou a existência de variantes moleculares em duas das classes. ABSTRACT: The genus Botryosphaeria is well known by the species that cause disease in a wide range of plant hosts economically important. This genus is currently composed of two species, Botryosphaeria dothidea and Botryosphaeria corticis. Integrity of cell walls is essential to survival of fungi, providing protection against mechanical damage and resistance to internal pressure. Because of the vital importance and chemical nature of fungal walls, they represent a target for the action of antifungal drugs. Chitin is a basic structural polymer, important for maintenance of cell form and walls rigidity, and to the formation of septa. Several genes coding specific chitin synthase isoforms have been cloned and characterized. From B. dothidea CBS115476 and B. corticis CBS119047 genomic DNA we amplified by PCR chitin synthase gene fragments, which were then cloned and sequenced. Analysis of the nucleotide and deduced amino acid sequences of 17 clones revealed three distinct classes of CHS (I, II and III). Phylogenetic analysis of these sequences allowed the establishment of phylogenetic relationships between species of Botryosphaeria and other fungi registered in the GenBank. In all phylogenetic analysis it was shown that the two species of Botryosphaeria grouped in a separate clade. Analysis of the CHS sequences from classes II and III allowed a distinction between the species B. dothidea and B. corticis, showing potential as a phylogenetic markers at the species level. The chitin synthase sequences from classe I did not allow a clear distinction between the two species. In hybridization experiments and using as probes three clones that were previously sequenced, each belonging to a distinct class of chitin synthase (I, II and III), chitin synthase gene fragments were detected in four Botryosphaeria strains. After hybridization, HindIII fragments were detected in all strains tested, for the three classes of probes. This indicates the presence of the gene sequences that encode chitin synthases in the four strains. The detection of a single fragment for each of the classes suggests that these genes are the single copy genes. However, the sequencing of multiple clones revealed the existence of molecular variants in two of the classes.