Proteínas recombinantes de Plasmodium Falciparum para deteção de malária por nanoimunoensaios

• Author(s): Silva, Isabel Bernardo Gonçalves Oliveira
• Date: 2013
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10362/10147
• Origin: Repositório Institucional da UNL
• Subject(s): Malária; HRPII; Hsp70; ELISA; Fluorescência; RDT
• Document Type: Master thesis
• Language: Portuguese
• Advisor(s): Franco, Ricardo; Gomes, Inês
• Contributor(s): RUN

Description

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia

Este trabalho teve como objetivo a produção e purificação de três proteínas recombinantes de sistemas de sobrexpressão bacterianos: a OmpF (outer membrane protein F), proteína presente na membrana de células de E. coli que auxilia a difusão de moléculas para o interior da célula; a Hsp70 (heat shock protein 70) proteína da família das chaperones produzida em estados febris, proveniente do Plasmodium falciparum, um dos parasitas responsáveis pela malária; e a HRPII (histidine rich protein II) proteína produzida pelo Plasmodium falciparum durante o seu ciclo de vida no hospedeiro. Também foi objetivo deste trabalho a utilização das proteínas recombinantes de Plasmodium falciparum no desenvolvimento de imunoensaios para deteção de malária. Os processos de produção e de purificação da proteína OmpF foram conseguidos com sucesso após a transformação de células de E. coli (DE3) BL21 Omp8. Os processos de expressão e de purificação da proteína Hsp70 foram otimizados em alguns parâmetros de forma a tentar aumentar a eficiência do processo. Conclui-se que o pré-inoculo deverá apresentar uma diluição de 1:50 e que o tempo de incubação após a indução com IPTG deverá ser de aproximadamente 16 horas. Quanto à proteína HRPII esta apresentou vários problemas durante os processos de produção e de purificação, mas foi possível determinar que durante o processo de produção se deve utilizar uma concentração de IPTG de 50 μM, baixando a temperatura de 37ºC para 16ºC no momento da indução. O tempo de incubação após a indução é um parâmetro que ainda deve ser otimizado; durante o processo de purificação as concentrações de Imidazole nos tampões de lavagem e de eluição ainda necessitam de otimização futura. De forma a utilizar bionanoconjugados constituídos por nanopartículas de ouro com o agente de revestimento MUA (ácido mercaptoundodecanóico) e conjugadas com anticorpos monoclonais anti-Hsp70 (2E6) em ensaios é necessário averiguar que estes são estáveis em diversas condições, nomeadamente à força iónica do meio assim como o valor de pH, e também quando tempo, estes poderão estar armazenados antes da sua utilização Neste trabalho foi possível chegar à conclusão que os bionanoconjugados AuNP-MUA-2E6 são estáveis numa gama de pH entre 2 e 12, num intervalo força iónica entre 0 e 2,5 M de NaCl e são também estáveis durante 3 meses armazenados a uma temperatura de 4ºC. Pretendeu-se caracterizar a utilização dos bionanoconjugados (AuNP-MUA-2E6) em imunoensaios em vários formatos: (i) ensaio de ELISA de forma a verificar se estes contribuíam para um aumento da sensibilidade do ensaio, tendo-se chegado a resultados promissores que tal acontece; (ii) em ensaios de fluorescência de modo a obter uma reta de calibração que possibilite a quantificação de antigénios Hsp70 em amostras reais, no entanto os resultados obtidos não foram satisfatórios; (iii) em ensaios em tiras de nitrocelulose com o intuido de proceder a um ensaio competitivo de ser fácil interpretação, os resultados obtidos indicam que tal é possível. Utilizaram-se os bionanoconjugados AuNP-MUA-anti-HRPII em ensaios de Western-Blot de forma detetar a presença de HRPII em diversas amostras obtidas ao longo do processo de produção e purificação e em culturas infetadas e não infetadas, revelando os resultados por quimioluminescência (método indireto) ou utilizando os bionanoconjugados (método direto) tendo-se concluído que a utilização dos bionanoconjugados para revelação é promissora, no entanto o método de quimioluminescência é mais sensível do que o método direto.