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Caracterização de múltiplos polimorfismos de Pneumocystis Jirovecii por multiplex-PCR/Single base extension

Author(s): FERNANDES, Camila Borges

Date: 2013

Persistent ID: http://hdl.handle.net/10362/13985

Origin: Repositório Institucional da UNL

Subject(s): Microbiologia médica; Epidemiologia médica; Biologia molecular; Parasitas; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas


Description

Pneumocystis jirovecii é conhecido por causar infecções específicas no aparelho respiratório de seus hospedeiros, principalmente em doentes imunocomprometidos, manifestando-se por uma pneumonia grave e por vezes fatal, normalmente designada por pneumonia por Pneumocystis. A caracterização da diversidade genética de P. jirovecii tem demonstrado que determinados polimorfismos de base única poderão ser reconhecidos como marcadores moleculares de eleição para o estudo da distribuição geográfica, vias de transmissão, resistência/susceptibilidade a fármacos, factores de virulência e genética populacional de subtipos genéticos. Este estudo teve como objectivo a caracterização de polimorfismos de P. jirovecii, através da metodologia PCR multiplex/Extensão de base única (do inglês single base extension), com a principal finalidade de constatar eventuais associações entre polimorfismos de base única, genótipos multilocus, e dados clínicos e demográficos da infecção. Sessenta e seis espécimes pulmonares, previamente considerados positivos para P. jirovecii, obtidos entre 2001 e 2012, a partir de doentes portugueses imunocomprometidos, foram seleccionados de forma aleatória para este estudo multilocus. PCR multiplex foi utilizada para a amplificação simultânea de três regiões genómicas: subunidade grande do rRNA mitocondrial, superóxido dismutase e dihidropteroato sintetase. Cinco polimorfismos de base única, previamente correlacionados com parâmetros da doença, foram genotipados por extensão de base única: mt85, SOD110, SOD215, DHPS165 e DHPS171. Um total de 330 polimorfismos de base única e 29 genótipos multilocus putativos de P. jirovecii foram identificados e caracterizados nos espécimes pulmonares analisados. Os padrões de distribuição dos polimorfismos foram analisados, sendo considerada a variação temporal e/ou geográfica das suas formas alélicas. Constatou-se grande diversidade genotípica entre os isolados de P. jirovecii que poderá ter influência a nível epidemiológico. Foram observadas associações estatísticas entre mt85/genótipos multilocus e parâmetros demográficos e clínicos. A correlação mais importante verificou-se entre mt85C e cargas parasitárias baixas a moderadas, enquanto mt85T foi associado com cargas parasitárias altas; MLG5, MLG9 e MLG13 foram associados com cargas parasitárias baixas, moderadas e altas, respectivamente. Tais associações demonstram que potenciais marcadores moleculares da infecção por P. jirovecii poderão existir e que polimorfismos/genótipos específicos poderão determinar perfis epidemiológicos da pneumonia por Pneumocystis. A análise genética cruzada permitiu verificar associações entre polimorfismos de base única. Os polimorfismos SOD110T e SOD215C, SOD110C e SOD215T, DHPS165A e DHPS171C, DHPS165G e DHPS171T foram associados estatisticamente. Os genótipos multilocus mais prevalentes foram considerados para o teste recombinatório d1. Dois genótipos multilocus (MLG7 e MLG9) foram observados com elevada frequência, e a análise genética indicou que estes se encontravam sobre-representados na população de P. jirovecii estudada. Estas evidências indicam que o fenómeno de desequilíbrio de ligação e a propagação clonal de subtipos genéticos é frequente, considerando que a espécie P. jirovecii poderá ser representada por uma população com estrutura epidémica. O presente trabalho confirmou a importância do estudo de polimorfismos em P. jirovecii, sugerindo que a caracterização multilocus poderá fornecer informação relevante para a compreensão dos padrões, causas e controlo da infecção, melhorando assim a investigação deste importante patogéneo.

Pneumocystis jirovecii is known for causing specific infections in the respiratory tract of humans, mostly in immunocompromised patients, leading to a severe, and often fatal, pneumonia known as Pneumocystis pneumonia. The characterization of the genetic diversity of P. jirovecii has shown that some specific single nucleotide polymorphisms have been recognized as the molecular markers of choice to study the geographical distribution, modes of transmission, drug susceptibility/resistance, virulence factors and population genetics of specific genetic subtypes. The gold of the present work was to characterize P. jirovecii polymorphisms, using the methodology Multiplex PCR/Single Base Extension, having as main purpose, the detection of possible associations between single nucleotide polymorphisms and multilocus genotypes with demographic and clinical data of infection by P. jirovecii. Sixty six pulmonary specimens previously identified as positive for P. jirovecii, collected between 2001 and 2012, from immunocompromised portuguese patients were randomly selected and included in this multilocus study. Multiplex-PCR was used for simultaneous amplification of tree genomic regions: mitochondrial large-subunit rRNA, superoxide dismutase and dihydropteroate synthase. Five single nucleotide polymorphisms correlated previously with parameters of disease were genotyped by Single Base Exrension: mt85, SOD110, SOD215, DHPS165 and DHPS171. A total of 330 single nucleotide polymorphisms and 29 potential P. jirovecii multilocus genotypes were identified and characterized in the samples studied. The polymorphisms distribution patterns were analyzed and the temporal and/or geographic variation of their allelic forms have been considered. There was a large genotypic diversity among isolates of P. jirovecii that may have influenced the epidemiology of infection. Statistical associations between mt85/multilocus genotypes and some demographic and clinical informations were observed. The most relevant correlation was observed between mt85C with low to moderate parasite load, whilst mt85T was associated with high parasite load. MLG5, MLG9 and MLG13 were associated with low, moderate and high parasite load, respectively. Such associations demonstrate that optimal molecular markers of infection by P. jirovecii exist and specific polymorphisms/genotypes may determine specific epidemiological profiles of Pneumocystis pneumonia. The cross-genetic analysis demonstrated statistically significant associations among single nucleotide polymorphisms. The polymorphisms SOD110T and SOD215C, SOD110C and SOD215T, DHPS165A and DHPS171C, DHPS165G and DHPS171T, were statistically associated. The most prevalent multilocus genotypes identified were considered in the recombination test d1. Two multilocus genotypes (MLG7 and MLG9) were observed in higher frequency, and the genetic analysis indicated at these multilocus genotypes are over-represented in the population of P. jirovecii studied. These evidences indicate that linkage disequilibrium and clonal propagation of genetic genotypes is common in this population, considering that the species P. jirovecii could be represented by an epidemic population structure. The present work confirmed the importance of the study of polymorphisms in P. jirovecii, suggesting that the multilocus characterization can provide useful information to understanding the patterns, causes and control of infection, enhancing the research of this important pathogen.

Document Type Master thesis
Language Portuguese
Advisor(s) MATOS, Olga; ESTEVES, Francisco
Contributor(s) FERNANDES, Camila Borges
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