Author(s): RIBEIRO, Marta Maria Ramos Soares
Date: 2015
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10362/19006
Origin: Repositório Institucional da UNL
Subject(s): Ciências biomédicas; Saúde pública; Diagnóstico; Terapêutica; Pneumocystis jirovecii.; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas
A pneumonia causada por Pneumocystis, conhecida por pneumocistose, ou PPc, é uma doença de alto relevo e preocupação a nível de saúde pública. O seu rápido diagnóstico é de grande importância, visto ser uma doença fatal em indivíduos com imunossupressão. Como tal, é imprescindível a continuação da pesquisa de novas abordagens de diagnóstico rápido para esta doença. A aplicação de anticorpos recombinantes adquiridos pela técnica de Phage display pode ser uma grande mais valia, não só do ponto de vista de diagnóstico, não tendo de se recorrer a kits de diagnóstico, como também terapêutico. Este estudo teve por objetivo a produção de fragmentos de anticorpos recombinantes com o auxílio da técnica de Phage display, para diagnóstico da pneumocistose. A fim de se pesquisar os anticorpos recombinantes monoclonais específicos para P. jirovecii foram realizados três estudos. No primeiro e segundo estudos, a pesquisa dos anticorpos recombinantes fez-se através de amostras biológicas aleatórias de lavados broncoalveolares (LBA) de doentes com presença de P. jirovecii. Para o terceiro estudo foi utilizada uma proteína recombinante purificada MsgC - glicoproteína Major de superfície (do inglês, Major surface glycoprotein) de P. jirovecii, a qual é composta por três fragmentos de péptidos imunogénicos. Na captura de fragmentos recombinantes anti- P. jirovecii, utilizaram-se no primeiro estudo três bibliotecas combinatórias de fragmentos de anticorpos recombinantes (scFv – Griffin1., Tomlinson J e I) e apenas uma biblioteca (Griffin 1.) para o segundo e terceiro estudos. No primeiro estudo obtiveram-se partículas fágicas monoclonais cuja presença foi validada com o antigénio MsgC, apresentando sequências com 550 a 750 pb, tamanho expectável para scFv. Na fase de produção de scFv em E. coli HB2151, não houve expressão de scFv, possivelmente, devido à sequência recombinante obtida possuir um codão terminal amber TGA em excesso, o que impossibilita a sua expressão. Para o segundo e terceiro estudos os resultados foram inconclusivos. Com base nos resultados obtidos neste estudo, pode-se assumir que apenas com a utilização de antigénio puro (MsgC recombinante) haverá maior hipótese de se obter scFv para poder utilizar no diagnóstico da pneumonia por Pneumocystis.
Pneumocystis pneumonia, also known as pneumocistosis or PcP, is a big concern in terms of public health. Naturally, a rapid diagnosis of this disease is of great importance, since it is fatal in individuals with immunosuppression. Due to this, it is essential to discover new methods to rapidly diagnose this disease. The application of recombinant antibodies obtained by phage display technique can be a great asset in this endeavour, not only for diagnosis but also as a therapeutic method. This study main aim was the production of recombinant antibody fragments using the phage display technique to diagnose PcP. In order to search for specific recombinant monoclonal antibodies for P. jirovecii, three studies were performed. In the first and second studies, recombinant antibodies were produced using random biological samples of bronchoalveolar lavage of patients infected with P. jirovecii. In the last study was used as a sample a purified recombinant protein MsgC - major surface glycoprotein of P. jirovecii, which is made of three fragments of immunogenic peptides. To capture anti-P. jirovecii recombinant fragments in the first study were used three combinatorial libraries of recombinant antibody fragments (scFv - Griffin1., Tomlinson I and J) whereas only one library (Griffin 1.) was used in the remaining studies. In the first study were obtained monoclonal phage particles, whose presence was validated with MsgC antigen, which presented between 550-750 bp, an expected size for scFv. ScFv production using E. coli HB2151 was unsuccessful since there was no expression of scFv. Potentially this was due to an amber termination codon TGA present in the recombinant sequence, which prevented its expression. The results for the second and third studies were inconclusive. Based on these results, we can conclude that using a purified antigen (e.g. recombinant MsgC) increases the odds of obtaining scFv that can be used in the diagnosis of Pneumocystis pneumonia.
