Author(s): VELEZ, André Filipe Marques
Date: 2012
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10362/19201
Origin: Repositório Institucional da UNL
Subject(s): Virus-like particles, vírus chikungunya, pLEXm, transfecção com polietilenimina,; Biologia molecular; Doenças tropicais; Chikungunya; Vacina; Mortalidade; VLPs - Virus Like Particles; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas
O vírus Chikungunya (CHIKV) é um alfavírus, transmitido por mosquitos, que causa infecção aguda no Homem caracterizada por febre, mialgia e poliartrite dolorosa e incapacitante que pode durar meses ou anos. Descrito pela primeira vez na Tanzânia em 1952, tornou-se endémico em África, Índia e sudeste Asiático. Desde 2005, os surtos no oceano Índico e no continente Asiático têm atingido proporções e virulência atípicas, com muitos milhares de indivíduos infectados e mortalidade associada. A mobilidade de indivíduos infectados e a alteração dos padrões de distribuição e abundância dos vectores devido a alterações climáticas, tornaram o CHIKV uma ameaça global sem estratégias de controlo eficazes. Uma abordagem para o controlo da transmissão será o desenvolvimento de uma vacina eficaz. As virus-like particles (VLPs) são uma classe segura e eficaz de vacinas que simulam a estrutura nativa das partículas virais. Neste trabalho pretendemos obter um vector de expressão recombinante, capaz de induzir a síntese de VLPs de CHIKV quando transfectado em culturas celulares, como fonte da sequência codificante da poliproteína estrutural para clonagem em baculovírus e produção de VLPs em células de insecto. A ORF estrutural de CHIKV foi amplificada por RT-PCR como um fragmento SacI-NotI e clonada no vector de expressão pLEXm a jusante do promotor forte da beta actina de galinha. Obtiveram-se vários clones com o tamanho correcto do inserto, os quais foram usados para transfectar células HEK 293T usando polietilenimina como agente de fusão. A análise por imunofluorescência indirecta (IF) e Western blotting (WB) de células transfectadas, usando um soro policlonal anti-CHIKV, demonstrou que cinco vectores recombinantes expressavam antigénios virais. Um clone apresentou níveis elevados de fluorescência apenas quando da permeabilização celular e induz, muito provavelmente, a síntese de uma glicoproteína E2 truncada (26 kDa) que não é transportada até à membrana citoplasmática. Três clones deram origem a intensidades de fluorescência relativamente fracas que poderão estar correlacionadas com menor taxa de tradução e/ou processsamento incompleto. As células transfectadas com pLCHIKS67 revelaram fluorescência e padrão proteico em WB semelhante aos de células infectadas com CHIKV. Ainda, o seu sobrenandante de cultura quando precipitado com PEG 8000 revelou (WB) uma composição de antigénios virais idêntica ao precipitado correspondente de células infectadas com CHIKV. A análise por microscopia electrónica de transmissão de células infectadas com CHIKV e de células transfectadas com pLCHIKS67 demonstrou a presença de VLPs nestas últimas, com dimensões e morfologia idênticas às partículas virais, e ainda um extenso rearranjo de membranas intracelulares, observado igualmente nas células infectadas, o qual deverá estar associado à tradução, processamento e transporte das proteínas estruturais. De acordo com os resultados obtidos, pLCHIKS67 será uma boa fonte da sequência nucleotídica da poliproteína estrutural para usar na geração de baculovírus produtores de VPLs de CHIKV.
Chikungunya vírus (CHIKV) is a mosquito-transmitted alphavirus that causes an acute infection in humans, characterized by fever, myalgia and painful invalidating poly-arthralgia that may last for months. CHIKV was first reported in Tanzania in 1952 and became endemic in Africa, India and South-East Asia. Since 2005, outbreaks in the Indian Ocean and Asian continent reached an atypical magnitude and virulence, with many thousands of people infected and associated fatalities. Travelling and changing patterns of vector distribution and abundance due to climatic changes, make CHIKV a global threat without effective control strategies. One approach to reduce the CHIKV burden is the development of a vaccine. Virus-like particles are a safe and highly effective class of recombinant vaccines that mimic the overall structure of virus particles. Accordingly, we aimed to obtain a recombinant vector, able to induce CHIKV VLPs upon cell transfection, as a source of CHIKV structural genes to construct a recombinant baculovirus for VLP production in insect cells. CHIKV structural ORF was amplified by RT-PCR as a SacI-NotI fragment, and cloned into the mammalian expression vector pLEXm downstream from the strong chick beta actin promoter. Several clones with the correct insert size were obtained and transfected into HEK 293T cells using polyethylenimine as the transfection reagent. Five recombinant vectors were shown to express CHIKV proteins by immunofluorescence (IF) and Western blotting (WB) with a polyclonal serum against CHIKV. One clone, with high levels of IF labelling, demonstrated a truncated viral polyprotein of 26 kDa on WB while three others, with a lower IF signal, originated low levels of viral envelope glycoproteins correctly processed. Cells transfected with clone pLCHIKS67 showed IF staining and viral glycoprotein WB pattern similar with those of cells infected with CHIKV. Precipitation with PEG 8000 of clarified cell culture medium from pLCHIKS67 transfected cells and from CHIKV infected cells generated pellets with an identical content of viral glycoproteins on WB, strongly indicating that pLCHIKS67 transfected cells express CHIKV structural proteins that are assembled into VLPs. Transmission electron microscopy of transfected cells demonstrated cytoplasmic membrane rearrangements similar to the vesicle arrays observed in CHIKV infected cells and confirmed the assembly of VLPs with size and morphology similar to the virus particles produced in infected cells. Therefore, pLCHIKS67 will be used as a source of CHIKV structural genes for construction of recombinant baculoviruses and VLP production in insect cells, well-known for allowing high yields of recombinant protein expression.
