Author(s): F. Simao, Marcio
Date: 2017
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.1/10812
Origin: Sapientia - Universidade do Algarve
Project/scholarship: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/5876/UID%2FMulti%2F04326%2F2013/PT;
Subject(s): Hereditary hemochromatosis; Hfe-KO mouse model; Osteoarthritis; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Outras Ciências Médicas
In this study, we aimed to investigate the molecular mechanisms responsible for development of osteoarthritis (OA) and osteoporosis (OP) phenotypes in hereditary hemochromatosis using the Hfe-KO mouse model. Results from the analysis of Hfe-KO mice articular cartilage showed that Hfe loss of function alone is not enough to promote an OA-like phenotype and there were no evidences for high iron deposition in articulations of Hfe-KO mice. However, in vitro characterization of Hfe-KO primary chondrocytes exposed to 50μM of iron citrate produced an OA-like phenotype, with lower extracellular matrix production and increase metalloproteases expression. In addition, we identified the presence of iron metabolism dysregulation in Hfe-KO cells which showed an increase in intracellular iron levels relatively to wild type (WT). These results suggested that OA phenotype results from the conjugation of Hfe-KO with direct iron overload exposure and / or other synergistic variables. In contrast, Hfe-KO mice (12- months-old) showed a bone loss phenotype with significant decrease in trabecular and subchondral bone. At 6 months of age no differences were observed in WT and Hfe-KO mice bone kept under standard diet but when subject to iron rich diets they showed opposite bone phenotypes, with increased bone mineralization for WT, likely resulting from a decrease in osteoclast activity, and bone loss for Hfe-KO mice associated with iron toxicity in bone tissue. In conclusion, our results indicate that iron rich diet promotes bone loss phenotype in Hfe-KO mouse model while it is not sufficient to induce OA in the absence of other insults.
Hemocromatose hereditária (HH) é uma patologia associada a um excesso de ferro sistémico responsável pelo desenvolvimento de múltiplas complicações incluindo cirrose, hepatocarcinoma, arritmia, diabetes, osteoartrose e osteoporose. O desenvolvimento do excesso de ferro na HH resulta de mutações em genes importantes no metabolismo do ferro com implicações na diminuição da expressão de hepcidina. A maior parte dos casos reportados de HH resultam de uma mutação pontual no gene que codifica para a proteína humana da hemocromatose (HFE). A alteração de uma adenina por uma citosina conduz a uma substituição de uma cisteína por uma tirosina na posição 282 da sequência de aminoácidos, implicando a perda de função da proteína e consequentemente a alterações na regulação da absorção de ferro intracelular pelas células, promovendo uma diminuição da expressão da hepcidina. Estas alterações levam progressivamente ao desenvolvimento de um excesso de ferro sistémico. A osteoartrose (OA) e a osteoporose (OP) são complicações muito comuns nos pacientes com HH e que contribuem para a diminuição da sua qualidade de vida. A osteoartrose caracteriza-se pela degradação da cartilagem articular em consequência de desequilíbrios entre o catabolismo e o anabolismo, sendo responsável pela perda de movimentos e dores nas articulações dos pacientes, podendo em casos mais extremos levar a substituição da articulação por próteses. A osteoporose caracteriza-se por uma perda de massa óssea generalizada que promove a incidência de fraturas e diminuição da mobilidade. Os níveis de ferro sistémico conseguem ser controlados através de flebotomias e terapêuticas com quelantes, contudo estas abordagens não são eficazes para parar a progressão destas patologias. Não existem muitos dados sobre a caracterização molecular dos mecanismos que estão na origem do desenvolvimento e progressão destas complicações musculoesqueléticas em pacientes com HH e a maior parte do que se sabe tem origem em estudos epidemiológicos ou descrições radiológicas do fenótipo. Neste estudo tivemos como principal objetivo a utilização do ratinho Hfe-KO para caracterizar os fundamentos que levam ao desenvolvimento de osteoartrose e osteoporose como consequência de HH. A análise da cartilagem articular dos ratinhos Hfe-KO foi primeiro realizada em ratinhos fêmea com 6 meses de idade. Resultados não revelaram diferenças significativas para os ratinhos Wild type (WT). Como o excesso de ferro nos tecidos associado ao HfeKO vai aumentando com a idade, decidimos avaliar a integridade da cartilagem articular em ratinhos Hfe-KO fêmea e macho com 12 meses de idade. Mais uma vez os resultados não revelaram diferenças significativas. Foi confirmado que os níveis de ferro sistémico estavam muito elevados, revelando um fenótipo semelhante à HH e ao mesmo tempo fizemos uma análise histológica com o método de Perls para avaliar a presença de depósitos de ferro na cartilagem articular de ratinhos machos Hfe-KO. Os resultados revelaram níveis de acumulação de ferro elevados no osso subcondral mas não na cartilagem articular, sugerindo que as grandes quantidades de ferro presentes na corrente sanguínea não se acumularam no interior das articulações dos ratinhos Hfe-KO por estas não serem irrigadas. Analisamos ainda a cartilagem articular de ratinhos Hfe-KO fêmea alimentados com uma dieta rica em ferro e ainda assim não foi observada qualquer diferença para o grupo controlo. Este conjunto de resultados sugere que a perda de função da Hfe não é suficiente para o desenvolvimento de um fenótipo de OA em ratinhos Hfe- KO. De forma a avaliar o impacto da exposição de condrócitos ao excesso de ferro, isolamos culturas primárias de condrócitos Hfe-KO e WT e submetemos as células a 10μM e 50μM de citrato de ferro. A caracterização da cultura de condrócitos Hfe-KO sem adição de ferro não revelou diferenças significativas para as células WT, contudo quando condrócitos Hfe-KO foram tratados com 50μM de citrato de ferro estes revelaram uma desregulação do metabolismo do ferro que levou a uma acumulação de ferro intracelular mais elevada que as células WT. Foi também possível observar que o tratamento com 50μM de citrato de ferro promoveu um fenótipo semelhante à OA em condrócitos Hfe-KO e WT, revelando diminuição na produção de matriz extracelular, aumento significativo da expressão de metaloproteinases e diminuição da expressão de agrecano. Os níveis da resposta molecular dos condrócitos Hfe-KO sugere uma suscetibilidade para o desenvolvimento de um fenótipo semelhante à OA quando exposto a cargas de ferro. Estes resultados sugerem que, no caso da articulação in vivo, só em caso de insulto que promova a entrada de sangue enriquecido em ferro na articulação e consequente aumento do ferro no meio ambiente dos condrócitos estarão reunidas condições para o desenvolvimento de um fenótipo de OA. A avaliação do fenótipo do osso no ratinho Hfe-KO foi realizada primeiramente em ratinhos machos com 12 meses de idade. O osso foi caracterizado através da utilização da técnica de microtomografia computadorizada (micro-CT), permitindo fazer uma análise tridimensional à microarquitectura do osso trabecular e subcondral. Os resultados permitiram verificar uma diminuição significativa do osso trabecular. subcondral, contudo, a níveis diferentes, o osso trabecular o fenótipo não foi tão evidente, pois verificamos que apenas o volume do osso estava significativamente diminuído, sugerindo variabilidade no fenótipo do osso dos ratinhos Hfe-KO. O osso subcondral por sua vez foi possível observar um fenótipo mais evidente, tendo não só o volume do osso diminuído, mas também diminuição significativa na espessura das trabéculas e um aumento da desorganização trabecular. Estes resultados sugerem que a perda de função do Hfe promove a perda de massa óssea, contudo nem todos os ratinhos Hfe-KO revelaram um fenótipo claro de perda de osso. Os resultados observados para os ratinhos Hfe-KO com 12 meses sugeriram uma penetração incompleta do fenótipo de perda de massa óssea, o que nos levou a desenvolver uma experiência para testar o impacto de uma dieta rica em ferro (1% ferro carbonil) no osso de ratinhos Hfe-KO com 6 meses. A avaliação do osso dos ratinhos Hfe-KO com 6 meses sujeitos a uma dieta controlo mostrou que aos 6 meses os ratinhos Hfe-KO não apresentam diferenças significativas para os WT, o que sugere que poderá ser a acumulação progressiva de ferro ao longo do tempo que pode levar à perda de massa óssea como observamos nos ratinhos Hfe-KO com 12 meses. A avaliação dos ratinhos WT e Hfe-KO sujeitos a uma dieta rica em ferro revelou surpreendentemente fenótipos opostos, por um lado os ratinhos WT revelaram um aumento de osso relativamente aos ratinhos WT sujeitos a uma dieta controlo. A avaliação dos níveis de formação do osso e reabsorção revelou que neste grupo a atividade dos osteoclastos estava diminuída e sem alterações significativas no número de osteoblastos, sugerindo que o aumento de osso verificado se deve à diminuição da reabsorção óssea. Para os ratinhos Hfe-KO sujeitos a uma dieta rica em ferro por outro lado foi claro o fenótipo de perda de osso observado, mostrando o efeito sinergético entre a dieta e a perda de função de Hfe. Verificamos uma diminuição significativa de osteoblastos no osteoide, acompanhado por uma diminuição da expressão dos marcadores associados à mineralização como a osteocalcina e lactoferrina. Verificamos ainda alterações significativas no metabolismo do ferro no tecido ósseo, com aumento de expressão da ferroportina, ferritina e receptor da transferrina 1. Estes resultados em conjunto com os parâmetros da microarquitectura do osso sugerem que a perda de osso possa estar relacionada com a morte de osteoblastos em consequência da toxicidade do ferro. Estes resultados em conjunto demonstraram que a perda de função de Hfe pode de facto contribuir para o desenvolvimento de fenótipos semelhantes à OA e OP, Contudo, a existência de variáveis adicionais capazes de contribuir para acelerar o desenvolvimento de fenótipos patológicos parece ser determinante, especialmente para o caso da osteoartrose. Estes resultados evidenciam a necessidade de promover a investigação nessa área de modo a identificar os fatores associados ao desenvolvimento dessas suscetibilidades e assim contribuir para desenvolver novas terapias capazes de retardar ou inibir o desenvolvimento de fenótipos de OA e/ou OP nos pacientes com HH.
This research was partially supported by Norte-01-0145-FEDER-000012 –“Structured program on bioengineered therapies for infectious diseases and tissue regeneration”. M. Simão was supported by a PhD fellowship from the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) with the reference SFRH/BD/77056/2011
