Author(s):
Cardoso, Sara de Jesus Dias
Date: 2019
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.1/12728
Origin: Sapientia - Universidade do Algarve
Project/scholarship:
info:eu-repo/grantAgreement/FCT/3599-PPCDT/PTDC%2FMAR%2F69749%2F2006/PT;
info:eu-repo/grantAgreement/FCT/3599-PPCDT/EXCL%2FBIA-ANM%2F0549%2F2012/PT;
info:eu-repo/grantAgreement/FCT/SFRH/SFRH%2FBD%2F89072%2F2012/PT;
Subject(s): RNA-Seq; Plasticidade fenotípica; Táticas alternativas de reprodução; Comportamento de corte; Salaria pavo; Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Biológicas
Description
Phenotypic plasticity is the ability of an individual genome to produce different phenotypes depending on environmental cues. These plastic responses rely on diverse genomic mechanisms and allow an organism to maximize its fitness in a variety of social and physical settings. The development of next-generation sequencing (NGS) technologies, especially RNA Sequencing (RNA-Seq), has made it possible to investigate the distinct patterns of gene expression known to be underlying plastic phenotypes in species with ecological interest. In teleost fishes, changes in phenotypes is often observed during the reproductive season, with shifts and adjustments in dominance status that can lead to the co-existence of multiple reproductive morphs within the same population. One such example is the peacock blenny Salaria pavo (Risso, 1810), a species where the intensity of mating competition varies among populations due to nest-site availability, such that two different levels of plasticity arise: 1) intraspecific variation in reproductive behaviour for males that can follow either of two developmental pathways, grow directly into nest-holder males, or behave first as female mimics to sneak fertilizations (sneaker males) and later transition into nest-holder males, and 2) inter-population variation in courting roles of females and nest-holder males. This system provides the ideal basis to apply RNA-Seq methods to study plasticity since differences in reproductive traits within and among populations can reveal which genetic and genomic mechanisms underpin the observed variation in behavioural response to changes in the social environment. However, the genomic information available for this species was scarce, and hence multiple sequencing techniques were used and the methodologies applied optimized throughout the work. In this thesis, we start by first obtaining a de novo transcriptome assembly to develop the first genetic markers for this species (Chapter 2). These microsatellites were used to elucidate the reproductive success (i.e. consisting of mating success and fertilization success) of male ARTs, which can be used as a proxy of Darwinian fitness (Chapter 3). In this study, we detected a fertilization success for nestholder males of 95%, and showed a stronger influence of the social environment rather than morphological variables in the proportion of lost fertilizations by nest-holder males of this species. Taking advantage of the developed transcriptome, we used highthroughput sequencing to obtain expression profiles for male morphs (i.e. intraspecific variation) and females in this species, and focus on the role of differential gene expression in the evolution of sequential alternative reproductive tactics (ARTs) that involve the expression of both male and female traits (Chapter 4). Additionally, we show how the distinct behavioural repertoires are facilitated by distinct neurogenomic states, which discriminate not only sex but also male morphs. Lastly, using two different target tissues, gonads and forebrain, we focus on the genomic regulation of sex roles in courtship behaviour between females and males from two populations under different selective regimes (inter-population variation), the Portuguese coastal population with reversed sex roles and the rocky Italian population with ‘conventional’ sex roles (Chapter 5). Here we demonstrate that variation in gene expression at the brain level segregates individuals by population rather than by sex, indicating that plasticity in behaviour across populations drives variation in neurogenomic expression. On the other hand, at the gonad level, variation in gene expression segregates individuals by sex and then by population, indicating that sexual selection is also acting at the intrasexual level, particularly in nestholder males by paralleling differences in gonadal investment. However, the genomic mechanisms underlying courtship behaviour were not fully elucidated, and more studies are necessary.
A plasticidade fenotípica consiste na capacidade de o mesmo genoma produzir diferentes fenótipos comportamentais dependendo das pistas ambientais recebidas. Estas respostas plásticas dependem de diversos mecanismos genómicos e permitem que o indivíduo maximize a sua fitness (aptidão) numa variedade de ambientes ecológicos. O desenvolvimento verificado nas tecnologias de sequenciação de alto desempenho ao longo da última década, globalmente denominadas de “Next Generation Sequencing” (NGS), permitiu o estabelecimento de métodos de análise e ferramentas genómicas que podem ser aplicadas em todos os sistemas ecológicos de interesse em biologia, sem a existência prévia de um genoma curado. Nomeadamente a tecnologia de sequenciação de ARN, conhecida globalmente como RNA-Seq, tornou possível a investigação dos perfis de expressão génica que se sabe serem determinantes na emergência de fenótipos plásticos, e consequentemente permitem determinar fenótipos em estados distintos de expressão genómica. Em peixes teleósteos, é possível observar com frequência modificações no fenótipo comportamental durante o período de reprodução, como por exemplo alterações e ajustes no estatuto de dominância que podem levar à coexistência de indivíduos que apresentam diferentes táticas de reprodução dentro da mesma população. Um desses exemplos é o peixe marachomba-pavão Salaria pavo (Risso, 1810), onde a intensidade na competição intra e intersexual varia entre populações sendo modulada pela disponibilidade de locais de nidificação, de forma a que dois níveis diferentes de plasticidade surgem: 1) variação intraespecífica no comportamento reprodutivo em machos que podem seguir uma de duas vias de desenvolvimento, investirem no seu crescimento e tornarem-se machos nidificantes na sua primeira época de reprodução, ou primeiro seguir uma tática de macho parasita onde investem em fertilizações furtivas, sendo que mais tarde no seu desenvolvimento fazem a transição para macho nidificante, e 2) variação interpopulacional nos papeis de corte de fêmeas e machos nidificantes. Os machos parasitas, conhecidos nesta espécie como “sneakers”, possuem uma particularidade que os tornam singulares, para além de imitarem a morfologia das fêmeas também conseguem imitar o seu comportamento de corte direcionado ao macho nidificante, o que lhes permite aproximarem-se discretamente dos ninhos dos machos e fertilizar parte dos ovos que as fêmeas depositam. Este sistema constitui a base ideal para aplicar métodos de RNA-Seq e estudar esta plasticidade fenotípica, uma vez que diferenças nas características reprodutivas dentro e entre populações podem revelar quais os mecanismos genéticos e genómicos subjacentes à variação observada em resposta a mudanças no ambiente ecológico. No entanto, a informação genómica disponível nesta espécie é reduzida e, por isso diferentes técnicas de sequenciação, assim como diferentes métodos de análise foram usados e otimizados ao longo deste trabalho. A presente tese é constituída por quatro trabalhos, sendo que no primeiro estudo se começa pela sequenciação de uma biblioteca de ARN proveniente de uma mistura de múltiplos indivíduos e de tecidos, de forma a captar a diversidade genética e desenvolver os primeiros marcadores genéticos nesta espécie (Capítulo 2). Com base nestes marcadores, microssatélites polimórficos, foi possível genotipar uma fração dos indivíduos da população existente na Ilha da Culatra (Ria Formosa, Portugal) bem como os ovos retirados de ninhos alvo, de forma a fazer análises de paternidade (Capítulo 3). Neste estudo, foi possível estimar o sucesso de fertilização de ovos de cada uma das táticas alternativas de reprodução, e usá-la como medida representativa de fitness de cada tática alternativa de reprodução nesta espécie. Os resultados indicam um sucesso de fertilização para os machos nidificantes de 95%, e mostramos que existe uma maior influência do ambiente social do que de variáveis morfológicas na proporção de fertilizações não obtidas pelos machos nidificantes, quando comparado com estudos anteriores. Usando o transcriptoma obtido no primeiro trabalho, avançámos com a caraterização genómica de cada um dos fenótipos presentas na população da ilha da Culatra, fêmeas, machos nidificantes, machos sneakers e machos de transição (machos que apenas investem no seu crescimento, não se reproduzindo, e consequente transição de sneaker para macho nidificante) (Capítulo 4). Para tal, foi sequenciado em profundidade o transcriptoma de cérebro de cada um deste fenótipos, e os perfis de expressão obtidos para machos e fêmeas desta espécie, onde o foco do estudo se centrava no papel da expressão génica diferencial na evolução de táticas reprodutivas alternativas sequenciais que envolvem a expressão de ambos os traços masculinos e femininos. Os resultados obtidos, mostram como repertórios comportamentais distintos são facilitados por estados neurogenómicos distintos, que discriminam não apenas o sexo, mas também as táticas alternativas de reprodução. Por fim, utilizando dois tecidos-alvo, gónadas e prosencéfalo, focámo-nos na regulação genómica dos papeis sexuais no comportamento de corte entre fêmeas e machos nidificantes de duas populações sob diferentes regimes seletivos, a população costeira portuguesa com papeis sexuais invertidos e a população rochosa italiana, com papeis sexuais ‘convencionais’ (Capítulo 5). Os resultados obtidos mostram que ao nível do cérebro, a variação na expressão génica segrega os indivíduos por população e não por sexo, indicando que a plasticidade no comportamento entre as populações induz uma maior variação na expressão neurogenómica. Por outro lado, ao nível das gónadas, a variação na expressão génica segrega os indivíduos por sexo e também por população, indicando que a seleção sexual está a atuar ao nível intrasexual, particularmente nos machos nidificantes, indo de encontro a diferenças detetadas entre populações no investimento alocado às gónadas. No entanto, os mecanismos genómicos subjacentes ao comportamento de corte não foram totalmente elucidados, e mais estudos são necessários.
The work presented here was developed at Instituto Gulbenkian de Ciência (IGC) in Oeiras, with the support of both ISPA – Instituto Universitário in Lisbon, for the maintenance of live fish, and Centro de Ciências do Mar (CCMAR) at Universidade do Algarve, for logistics and support during fieldwork in Ria Formosa.
