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Transport in the blood of an anti-tumor water-soluble rutheniun cyclopentadienyl complex: a fluorescence study on albumin binding

Author(s): Medina Martínez, Ana Maria

Date: 2014

Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.1/8664

Origin: Sapientia - Universidade do Algarve

Subject(s): Cancro; Albumina do plasma humano; Ruténio (II); Complexos de Ru(Cp); Espectroscopia de fluorescência; Locais de ligação; Biodisponibilidade; Cancer therapy; Human serum albumin; Fluorescence spectroscopy; Ruthenium complexes; Ruthenium; UV-Vis absorbance; Binding site; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química


Description

O Cancro é a segunda maior causa de morte em países desenvolvidos. Estima-se que o número global de mortes por cancro aumente em 50% até 2030, criando a necessidade urgente de encontrar soluções para este problema de saúde global. A cisplatina, carboplatina e oxaliplatina são os únicos metalofármacos aprovados para uso clínico em todo o mundo mas, apesar da sua eficácia, apresentam efeitos secundários que limitam muito a sua utilização. Os compostos de ruténio são já reconhecidos como uma alternativa promissora aos fármacos de platina usados em quimioterapia, dada a sua menor citotoxidade e maior selectividade. Além disso, oferecem diferentes mecanismos de acção e um espectro de atividade diferente, mais alargado, que os metalofármacos de Pt. O seu mecanismo de acção é intensamente estudado actualmente e a ligação a proteínas séricas parece ter um papel importante na sua resposta biológica. O estudo da interacção com proteínas séricas e com a albumina do plasma humano (HSA) em particular reveste-se de uma grande importância no contexto do desenvolvimento de metalofármacos. Por um lado, a interacção com a albumina tem um impacto importante na biodisponibilidade do complexo em estudo. Por outro lado, a HSA desempenha um papel fulcral no transporte de compostos endógenos e exógenos, sendo também crucial como veiculo transportador de compostos terapêuticos para lhe permitir atingir as células e tecidos-alvo onde exercem a sua acção. Além disso, é um requisito da FDA (Food and Drug Administration) que resultados da interacção com proteínas séricas sejam incluídos no processo de pre-selecção de potenciais fármacos e metalofármacos. Neste trabalho estudou-se a interacção de um complexo organometálico de ruténio(II) de estrutura em banco de piano com a albumina de plasma humano (sem ácidos gordos, fafHSA). O complexo [RuII(Cp)(bipy)(CO)][PF6] (designado neste trabalho por RuC), com uma actividade moderada para o adenocarcinoma de ovário humano, é solúvel em água o que o torna muito interessante no contexto de desenvolvimento de novos agentes terapêuticos. A sua ligação à HSA foi estudada em meio aquoso a pH 7.4 (tamponizado com HEPES) e à temperatura de 37ºC por espectroscopia de UV-Vis e espectroscopia de Fluorescência (em estado estacionário e resolvida no tempo) usando a emissão do resíduo Trp214 da proteína como sonda de fluorescência intrínseca. A interacção do complexo com a HSA ocorre rapidamente e resulta na extinção da fluorescência do Trp214 por um processo misto estático e dinâmico, para o qual se obtiveram as constantes de Stern-Volmer KD = (4,8 ± 0,3)x104 M-1 e KS =(2,3 ± 0,7)x104 M-1 (calculadas a em=338 nm pelo método dos mínimos quadráticos para um nível de confiança de 95%). O modelo proposto para a interacção RuC–HSA engloba a formação de dois aductos complexo-proteína de estequiometrias 1:1 e 1:2 para os quais são calculadas constantes de formação condicionais log β’1= (4,78 ± 0,01) (para o aducto 1:1 {HSA-RuC}) e log β’2= (9,52 ± 0,01) (para o aducto 1:2 {HSA-(RuC)2}. Reacções de competição com “marcadores” conhecidos como a varfarina e a dansilglicina, para os quais a ligação à HSA é específica e está bem estudada, são utilizadas para obter informação sobre os locais de ligação do RuC à proteína. Os resultados obtidos neste trabalho permitem concluir que o complexo organometálico estudado interactua com a HSA de forma moderada, podendo ser eficientemente transportado pelo sangue através da ligação a esta proteína.

Ruthenium (Ru) complexes have captivated an increasing interest in recent years; they are a promising alternative to platinum-based complexes due to the fact that some of them have been repeatedly described for showing higher selectivity and lower cytotoxicity regarding their effects on cancer cells. The interactions studied between the Ru-complexes and serum proteins such as fatty acid free Human Serum Albumin (fafHSA) are of very high importance considering that their bioavailability and effects depend on their binding to albumin to reach the targeted cells. In addition, the Food and Drug Administration (FDA) has set the report on plasma protein binding for prodrugs as a requirement in order to do the screening for potential therapeutic agents. The interactions and several aspects related to the binding between the ruthenium (II) complex [RuII(Cp)(bipy)(CO)][PF6] (or RuC, also named pmc44) and HSA are addressed using fluorescence spectroscopy, steady-state and time-resolved measurements, and UV-Visible absorption in 10 mM HEPES buffered medium pH 7,4. Additionally, in order to obtain a deeper insight into the HSA binding properties of the complex at the specific drug binding sites, displacement experiments with the site markers Warfarin and Dansylglycine (for which the binding site is well known) were performed. The results show that the complex strongly quenches the intrinsic fluorescence of albumin and that the interaction is quite fast, indicating that the complex successfully binds the protein. The outcome from the Stern-volmer linearizations (both time-resolved and steady-state measurements) displayed more than one type of quenching mechanism; albumin fluorescence is quenched by a combination of dynamic and static quenching mechanisms. The most representative values obtained for KD and KS from the averages were (4,8 ± 0,3)x104 M-1 and (2,3 ± 0,7)x104 M-1 respectively, calculated with the Stern-Volmer linearization at em=338 nm by a Minimum Square Fit procedure with variance analysis (ANOVA) with a 95% confidence level. A speciation model with two protein-RuC adducts is proposed with global conditional binding constants of log β’1= (4,78 ± 0,01) (for the 1:1 adduct {HSA-RuC}) and log β’2= (9,52 ± 0,01) (for the 1:2 adduct {HSA-(RuC)2} with a fitting parameter of 1,16x105 using the computer program PSEQUAD. The conclusions achieved with the site markers´ experiments revealed that the complex binds to both sites I and II of the protein. Altogether, the results from this work indicated that the complex studied can bind human serum albumin in a moderate way and thus it be efficiently transported in the blood by HSA.

Dissertação de mestrado, Qualidade em Análises, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2014

Document Type Master thesis
Language English
Advisor(s) Tomaz, Ana Isabel; Cavaco, Isabel
Contributor(s) Medina Martínez, Ana Maria
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