Author(s):
Feiteiro, Joana Rita Oliveira
Date: 2013
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.6/3243
Origin: uBibliorum
Subject(s): Artéria umbilical - Células musculares lisas; Canais de CNG (Canais operados por nucleotidos cíclicos); Monofosfato guanosina cíclico; Nucleótidos cíclicos - Compartimentação
Description
Os canais de CNG são geralmente expressos em foto-recetores e em neurónio sensoriais oftativos e traduzem as alterações nas concentrações de cGMP e de cAMP, numa resposta elétrica e/ou num sinal de Ca2+ intracelular. Os CNG são ativados através da ligação direta a nucleótidos cíclicos, cAMP e cGMP. A síntese do monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) é controlada por dois tipos de guanilato ciclase (GC) que diferem na sua ativação e localização celular: a CG membranar (pGC) presente na membrana plasmática, a qual é ativada pelo péptido natriuretico, como o péptido natriuretico auricular (ANP); e a GC solúvel (sGC) que esta localizada no citosol e a sua ativação é induzida pelo óxido nítrico (NO). O NO e o ANP usam o cGMP como segundo mensageiro. Existem muitos casos em que a ativação da pGC e da sGC conduz a diferentes efeitos funcionais, uma explicação para esses efeitos funcionais diferentes é o aumento do cGMP em locais subcelulares específicos, regulam diferentes alvos em distintas partes da célula. Estudos recentes realizados pelo nosso grupo em células musculares lisas da artéria umbilical humana demonstraram que a testosterona ativa os canais BKCa e KV devido à ativação da proteína cinase G (PKG). Além disso, o nosso grupo observou que a testosterona e o ANP, mas não SNP (nitroprussiato de sódio), estimula a atividade destes canais de potássio, o que sugere que a testosterona aumenta os níveis de cGMP por ativação pGC. Este estudo também sugeriu que esta hormona relaxa o musculo vascular através da ativação da pGC aumentado o nível intracelular do cGMP. Estes estudos também demonstraram que o ANP aumenta os níveis intracelulares de cGMP pela ativação da pGC e o NO aumenta os níveis intracelulares de cGMP através da ativação da sGC. Neste sentido o objetivo deste trabalho é analisar o efeito vasodilatador da testosterona e analisar a compartimentação do cGMP a nível vascular através da ativação dos CNG sensíveis a cGMP e a possível implicação das fosfodiesterases (PDE). A técnica patch clamp na configuração whole cell foi usada para medir o sinal de ativação dos canais de CNG. As células musculares lisas da artéria umbilical humana são infetadas com o adenovírus WT-CNGA2. Os compostos utilizados foram: ANP (0,1μM e 1μM), SNP (10μM e 100μM), IBMX (3-isobutil-1-metilxantina) (100μM, inibidor não selectivo das PDE), To-156 (1μM, inibidor especifico da PDE5), ciloestamida (10μM; inibidor especifico da PDE3) e Sp-8 ((8- (4-Clorofeniltio)- 3', 5'-monofosfato cíclico de guanosina) (100μM, análogo da molécula cGMP) e testosterona ( 0,1, 1 e 10μM). Analisando os resultados obtidos, observa-se que o ANP, SNP induzem um diferente aumento da ICNG. O sinal do cGMP induzido pelo ANP parece ser controlado pela PDE5 e pela PDE3. Contudo, a administração do SNP parece criar dois efeitos separados, um mais localizado junto à membrana plasmática que é controlado pela PDE3 e pela PDE5, e o outro efeito localizado no interior das células que é regulado apenas pela PDE3. Em relação ao efeito da testosterona, observa-se que esta hormona ativa os CNG e que esta ativação e dependente da sua concentração. Em suma, a distribuição temporal e espacial diferente do cGMP pode contribuir para efeitos específicos do ANP e de dadores do NO na função vascular. A testosterona age pelo aumento do cGMP que induz a ativação da PKG.
Cyclic nucleotide-gated (CNG) channels are usually expressed in photorecetors and in olfactory neurons sensory, and they translate changes in intracellular cyclic nucleotide concentration in electrical response and/ or a sign of Ca2+intracellular. They open by the direct binding of cAMP and cGMP. The cGMP synthesis is controlled by 2 types of guanylyl cyclases (GC) that differ in their cellular location and activation by specific ligands: a particular CG (pGC) present at the plasma membrane, which is activated by natriuretic peptides such as atrial natriuretic pepetide (ANP); and a soluble guanylyl cyclase (sGC) present in the cytosol and activated by nitric oxide (NO). NO and ANP use cGMP as second messenger, there are many instances in which activation of pGC and sGC leads to different functional effects, one explication for different functional effects is that cGMP rises in specific subcellular locations, regulating different targets in different parts of the cell. The studies performed by our group in human umbilical artery smooth muscle cells (HUASMC) demonstrated that testosterone activates BKCa and KV channels due to PKG activation. Moreover, our group show that testosterone and ANP, but not sodium nitroprusside (SNP), stimulate the activity of these potassium channels, which suggest that testosterone increases cGMP levels by activating pGC. This study also demonstrated that ANP increases cGMP levels by activating particulate GC and NO incrases cGMP levels by activating soluble GC. In this sense, the aim of this work is analyze the compartmentalization of the cGMP at level vascular through the CNG activated by increased levels of cGMP and the possible involvement of the phosphodiesterases (PDE) and to analyze the vasodilator effect of testosterone through the cGMP-activated CNG. The whole cell configuration of patch clamp technique was used to measure the signal activation of CNG channels. The CNG channels are activated by cGMP. Human umbilical artery smooth muscle cells were infected with WT CNGA2 encoding adenovirus. The chemicals used in the experiments were: ANP (0,1μM and 1μM), SNP (10µM and 100μM); 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX; 100μM), a nonselective PDE inhibitor; To-156 (1µM), a PDE5 inhibitor; cilostamide (10µM), a specific PDE3 inhibitor and 8-(4-Chlorophenylthio)guanosine-3',5'-cyclic monophosphate (Sp-8) (100µM) which is an analogue of cGMP, and testosterone (0.1, 1 and 10μM). The results demonstrate that ANP and SNP stimulated in a different level the ICNG. The particulate pool of cGMP modulated by ANP seems to be controlled by the PDE5 and PDE3. Moreover, the administration of SNP seems to create two separated polls, one localized next to the plasma membrane , that are controlled by the PDE5 and PDE3, and other poll that are localized in the cytosol of the cells that is regulated only by PDE3. Concerning the effect of testosterone was observed that the testosterone activates the CNG and that this activation is dependent on its concentration. In summary, our results demonstrate that testosterone acts by increasing cGMP that induced the activation the PKG and differential spatial and temporal distributions of cGMP may therefore contribute to the specific effects of natriuretic peptides and NO donors in the vascular function.