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Implementação de novas estratégias na purificação da enzima catecol-O-metiltransferase Humana

Author(s): Nunes, Vanessa Sofia Lopes

Date: 2009

Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.6/3861

Origin: uBibliorum

Subject(s): Catecol-O-metiltransferase (COMT); Cromatografia de interacção hidrofóbica; Enzima - COMT; COMT - Estrutura; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química


Description

A enzima catecol-O-metiltransferase (COMT), tem vindo a despertar grande interesse na comunidade científica desde a sua descoberta em finais dos anos 50. Devido à função biológica que desempenha, esta enzima tem sido associada a diversas doenças humanas, tal como a Doença de Parkinson (DP), a esquizofrenia ou o cancro associado a estrogénios. De facto, são actualmente administrados inibidores da COMT como adjuvantes na terapia da DP. Assim, torna-se necessário o planeamento e desenvolvimento de processos de purificação de COMT solúvel humana (hSCOMT), que permitam obter enzima activa e pura em quantidade suficiente para utilização em posteriores estudos farmacológicos e estruturais. A Cromatografia de Interacção Hidrofóbica (HIC) surgiu recentemente como uma técnica bastante eficiente no isolamento de hSCOMT. No entanto, as concentrações moderadamente elevadas de Sulfato de Amónio (SA), geralmente usadas na promoção de interacções hidrofóbicas, podem levar à desnaturação de proteínas mais sensíveis. Uma alternativa bastante viável para evitar este fenómeno poderá ser o Citrato de Sódio (CS), já que o citrato é um ião anti-caotrópico e biodegradável e está descrito como um poderoso estabilizador proteico. Assim, a HIC foi utilizada no passo chave do processo de purificação de hSCOMT, onde vários sistemas de dois sais constituídos por SA e CS, aliados a baixa temperatura (5°C), foram aplicados e testados em dois adsorbentes hidrofóbicos típicos, octil- e butil-Sepharose. O suporte octil possui uma cadeia n-alquil maior, de 8 átomos de carbono, apresentando uma maior hidrofobicidade, e, portanto, requer menores concentrações de sal (25 mM SA e CS) na ligação completa de hSCOMT que a resina butil (300 mM SA e 200 mM CS). Em ambos os adsorbentes, a eluição total da enzima foi conseguida com a diminuição da força iónica até 0 mM de sal. A estratégia desenvolvida no suporte butil leva a uma quebra significativa na actividade de hSCOMT, devido ao uso de concentrações mais elevadas de sal no passo de adsorpção, apesar de ser alcançado um grau de pureza aceitável. Por outro lado, a estratégia do suporte octil permite a ligação e eluição completa de hSCOMT com baixas concentrações de sal, atingindo-se um excelente grau de pureza e uma degradação basal da enzima que se traduz em elevados níveis de actividade específica de hSCOMT. De facto, os níveis de SA foram reduzidos em 96% relativamente a estratégias de HIC já descritas na literatura com recurso a gradientes por passos de SA apenas. De igual forma, a manipulação da temperatura no passo de eluição na estratégia descrita representou uma vantagem adicional para uma maior recuperação de hSCOMT sem agregação nos rendimentos obtidos. Assim, a inclusão de concentrações basais de CS e baixa temperatura em estratégias de HIC permitiu a redução da degradação de hSCOMT, resultando em elevados níveis de actividade, assim como a obtenção de enzima com um grau de pureza excelente, apenas obtido após dois passos cromatográficos realizados em estudos anteriores.

Document Type Master thesis
Language Portuguese
Advisor(s) Queiroz, João António de Sampaio Rodrigues; Passarinha, Luís António Paulino
Contributor(s) Nunes, Vanessa Sofia Lopes
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