Author(s): Costa, Marta Isabel Nunes
Date: 2011
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.6/3877
Origin: uBibliorum
Subject(s): Transtirretina - Doença de Alzheimer; Metalotioneína - Doença de Alzheimer; Plexo coroideu; Estradiol - Doença de Alzheimer; Transfecção; Doença de Alzheimer - Estrogéneos; Domínio/Área Cientifica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química
O envelhecimento progressivo das populações dos países ocidentais, tem vindo a agravar a incidência de patologias neurodegenerativas, nomeadamente da doença de Alzheimer (AD). Esta patologia caracteriza-se pela deposição extracelular de fibrilhas do péptido β amilóide (Aβ) no córtex cerebral, levando à degeneração das células nervosas circulantes. A transtirretina (TTR), sintetizada principalmente no fígado e plexos coroideus (CPs), parece sequestrar o Aβ, prevenindo a formação dos agregados amilóides. As metalotioneínas (MTs) são proteínas de baixo peso molecular cuja expressão parece estar alterada em cérebros com AD. O aumento da expressão de MT-1/2 e a diminuição de MT-3 em doenças neuroinflamatórias tem suscitado um interesse crescente no papel destas proteínas na patogénese da AD. O reconhecimento das funções da MT-1/2 na captação de espécies reactivas de oxigénio (ROS), na viabilidade neuronal e no controlo da concentração de iões metálicos envolvidos na agregação amilóide, tem reforçado o interesse da proteína na neurodegeneração e neuroprotecção. Contudo, dados recentes indiciam que a MT-1/2 pode comprometer a remoção de Aβ, ao interagir com a TTR. Nesta perspectiva, o esclarecimento dos mecanismos que controlam os níveis de TTR e de MT-1/2 nos CPs pode prestar um contributo valioso ao desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas e de diagnóstico para a AD. Com este trabalho pretendeu-se avaliar o efeito de uma hormona com conhecidos efeitos neuroprotectores, o estradiol (E2,) na expressão de TTR e de MT-1/2 nos CPs, recorrendo a uma linha celular de CP de rato (RCP). Foi ainda objectivo deste trabalho optimizar as condições de transfecção das linhas celulares RCP, com Lipofectamine 2000TM, e HEK 293, pelo método do CaCl2, com o intuito de estabelecer metodologias práticas e eficazes para futuros estudos. As culturas da linha celular RCP foram estimuladas com várias concentrações de E2 (0, 1, 10, 100 e 1000nM) durante 6, 12, 24 e 36h. Os extractos proteicos das células foram analisados por Western blot para avaliar os níveis de expressão de TTR e de MT-1/2. Nas células tratadas com E2, os níveis de expressão de TTR aumentaram às 12h de estímulo com hormona a 10 e 100nM (p< 0,05). O efeito da hormona esteróide foi máximo às 24h de estímulo com E2 a 10nM (p< 0,001), sendo os níveis de proteína aproximadamente 2 vezes mais elevados que nas células não estimuladas. Relativamente ao efeito da hormona na expressão de MT-1/2, os resultados revelaram aumentos significativos às 12h de estímulo para todas as concentrações de hormona testadas. 24h após o estímulo hormonal, a expressão de MT-1/2 permaneceu significativamente elevada, comparativamente ao controlo (0nM), sendo o efeito atenuado às 36h de estímulo. Posto isto, conclui-se que o E2 regula positivamente a expressão de TTR e MT-1/2 na linha celular RCP e este efeito pode constituir um mecanismo importante subjacente ao efeito neuroprotector da hormona. As experiências efectuadas para a optimização da transfecção em HEK 293 com CaCl2 mostraram que o pH e concentração dos tampões, a densidade celular e a concentração de plasmídeo são parâmetros críticos no processo de transfecção. Obteve-se uma eficiência de transfecção entre os 40 e os 60%, usando 5μg de plasmídeo, CaCl2 a 300mM, tampão HBS 2x pH 7,05 e uma densidade celular entre os 60-80%. No caso da transfecção na linha RCP com Lipofectamine 2000TM terão que se testar mais condições para optimizar a técnica.
In developed countries, the progressive aging of the population has lead to an increase of neurodegenerative pathologies, particularly Alzheimer’s disease (AD). AD is characterized by an extracellular deposition of amyloid fibrils, in the cerebral córtex, causing the degeneration of the surrounding nervous cells. Transthyretin (TTR), a protein that is majority expressed in the liver and choroid plexus (CPs), seems to sequester the amyloid beta peptide (Aβ), preventing the formation of amyloid aggregates. The metallothioneins (MTs) are low molecular weight proteins whose expression seems to be altered in AD brains. The higher expression of MT-1/2 and diminished levels of MT-3 in neuroinflammatory diseases has an increasing interest in its role in AD pathogenesis. The recognition of the ability of MT-1/2 in scavenging oxygen reactive species (ROS), in neuronal viability and in the control of metal ions involved in Aβ aggregation, has emphasized the interest of these proteins in neurodegeneration and neuroprotection. Nevertheless, recent studies suggest that MT-1/2 in interaction with TTR may compromise Aβ clearance. In this context, the elucidation of the mechanisms which control TTR and MT-1/2 levels in CPs could provide a good approach in the development of novel therapeutic and diagnostic targets in AD. The aim of this study was to evaluate the effect of estradiol (E2), an hormone with neuroprotector effects, in TTR and MT-1/2 expression in CPs, using a rat CP cell line (RCP). Also, in the present study the transfection conditions for the RCP using the Lipofectamine 2000TM reagent and for the HEK 293 cell line, using the CaCl2 method. This second aim intended to achieve novel pratical methodologies for future works. Cells were stimulated with different hormone concentrations (0, 1, 10, 100 e 1000nM) during various time periods (6, 12, 24 e 36h). Total protein extracts were collected and TTR and MT1/2 expression were analyzed by Western blot. The results from the stimulation of RCP cells with E2 showed that TTR expression was upregulated after 12h for concentrations between 10 and 100nM (p <0,05), and its expression nearly doubled after 24h for 10nM of E2. For the MT-1/2 expression with the E2 stimulation, the results showed that the protein levels were higher at 12 and 24h in all concentrations tested. And, this up-regulation was attenuated after 36h of stimulation. With the results obtained it can be concluded that the E2 up-regulates both TTR and MT-1/2 expression levels in RCP. This observed effect can constitute an underlying mechanism in understanding the neuroprotector role of E2. The optimization of the transfection conditions in HEK 293 with CaCl2 revealed that several tested parameters were extremely important in the overall process. So, factors as the pH and concentration of buffers, cellular density and plasmid concentration seem to be crucial for the transfection success. After the optimization of all conditions, a transfection efficiency of 40-60% was obtained, using 5µg of plasmid, CaCl2 300mM, HBS2x buffer pH 7,05 and a cellular confluence between 60-80%. The transfection of RCP cells using Lipofectamine 2000TM was not completely optimized and additional assays are required.
