Author(s): Tente, Teresa Susana Ferreira
Date: 2008
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.6/3909
Origin: uBibliorum
Subject(s): Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química
Author(s): Tente, Teresa Susana Ferreira
Date: 2008
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.6/3909
Origin: uBibliorum
Subject(s): Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química
Nas últimas duas décadas, devido ao crescente interesse do uso de DNA plasmídico como vector não viral na terapia génica, bem como na produção de vacinas de DNA, aumentou significativamente a necessidade de produzir grandes quantidades de DNA plasmídico para fins terapêuticos. Reveste-se assim de grande importância a optimização dos processos de produção e purificação, tendo em vista a obtenção de grandes quantidades de um produto de elevado grau de pureza, com minimização dos custos de produção. Os métodos de separação e purificação baseados em interacções de afinidade são bastante promisssores, devido à sua elevada especificidade, no entanto, os custos elevados das macromoléculas utilizadas como ligandos, limita a sua aplicação potencial generalizada. Assim sendo, há a necessidade de usar outros ligandos mais baratos, surgindo como alternativa as pequenas moléculas que ligam ao DNA, destacando-se os antibióticos antitumorais e agentes anticarcinogénicos. A utilização destas pequenas moléculas como ligandos na purificação de afinidade de DNA plasmídico (pDNA), podem, num futuro próximo, ser implementadas como técnicas preferenciais na purificação de DNA com enorme potencial. O principal objectivo deste trabalho foi testar a possibilidade de utilizar, os antibióticos canamicina e berenil como ligandos de afinidade na purificação de plasmídeos. Foi realizado o estudo da interacção da canamicina e do berenil com um plasmideo modelo (pVAX1LacZ) através da titulação fluorimétrica do pDNA com brometo de etídio (BrEt) pelo método de Strothkam, na ausência e na presença de cada um dos ligandos. Foi também determinada a influência da concentração de cloreto de sódio (NaCl), nesta interacção Os dados foram analisados utilizando o gráfico e a equação de Scatchard tendo-se determinado para cada caso a constante de ligação. Ambos os fármacos estudados apresentam um comportamento competitivo em relação ao BrEt. O berenil parece ser um ligando de afinidade promisor para ser utilisado na purificaçõa de pDNA. De facto, para este ligando e para uma concentração de 1,0 M de cloreto se sódio registou-se uma elevada constante de ligação (12849,00 M-1) que diminui substancialmente para concentrações superiores ou inferiores deste sal. Estes resultados são importantes para uma possível utilização em cromatografia de afinidade, uma vez que sugerem um método simples para a ligação e eluição do plasmídeo de um suporte derivatizado com este ligando. Foi testada a utilização do berenil como ligando em cromatografia de afinidade. Contudo os ensaios preliminares, não foram muito conclusivos, uma vez que, o facto de não se ter conseguido reter o pDNA na coluna, pode ser devido à baixa densidade de ligandos imobilizados na coluna.
In the last two decades, the use of plasmid DNA as a non viral vector in gene therapy and DNA vaccination for the treatment of cancer and infectious diseases has gain a considerable interest. So, it is essential to devise processes whereby plasmid DNA can be manufactured to meet the quality and economic requirements projected for future gene therapy and DNA vaccine agents. The methods of separation and purification based in affinity interactions are very promising, due to its higher specificity, however, the utilization of expensive macromolecular biomolecules prevents their wide application. The utilization of small molecules that bind DNA with high specificity, like certain antibiotics and anticancer agents could represent a good alternative. The utilization of these small molecules as ligands in affinity purification of plasmid DNA, has a great potential and in the future could be a preferencial metodology for DNA purification. The aim of this work was to test the possibility of using antibiotics (kanamycin and berenil) with affinity for the DNA as ligands in plasmid purification. The interaction between kanamycin and berenil with a model plasmid (pVAX1LacZ) was assessed by fluorimetry titration of the pDNA with ethidium bromide, in the absence and in the presence of the ligand, by the method of Strothkamp. The influence of sodium chloride (NaCl) in this interaction was also evaluated. All the data was analysed using the plots and the equation of Scatchard and the binding constants determined for each condition. Both compounds showed a competitive behaviour in relation to the BrEt and berenil seems to be a promising ligand for the affinity purification of pDNA. In fact, for this ligand and for a sodium chloride concentration of 1,0M it was found a high binding constant (12849,00 M-1) that decreases for higher and lower concentration of this salt. These results are important for the possible utilization in affinity chromatography as they suggests a simple method for binding and elution of the plasmid to a ligand derivatized support The utilization of berenil in affinity chromatography was assessed, however the preliminary assays were not very conclusive, as although the plasmid DNA was not retained in the column, this could be due to the lower density of ligands immobilized in the column.