Author(s):
Martins, Ana Isabel Figueiredo
Date: 2010
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.6/3948
Origin: uBibliorum
Subject(s): Fluorimetria; Rodamina 123 - Plasma de rato; Glicoproteína-P; Glicoproteína-P - Inibidores; Glicoproteína-P - Células tumorais; Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Químicas
Description
A resistência a múltiplos fármacos (multidrug resistance, MDR) constitui um dos maiores obstáculos no tratamento do cancro. Acredita-se que um dos principais mecanismos envolvidos na MDR seja a sobrexpressão, em células cancerígenas, de um transportador membranar de efluxo de fármacos dependente de ATP, a glicoproteína-P (gp-P). A gp-P desempenha um papel significativo na absorção e disposição de muitos fármacos, incluindo anticancerígenos. Em particular, a sobrexpressão da gp-P em células cancerígenas confere resistência ao impedir a acumulação intracelular de fármacos. O objectivo deste estudo foi desenvolver e validar um método fluorimétrico rápido e sensível, em plasma de rato, para apoiar a identificação in vivo de inibidores da gp-P, usando a rodamina 123 como uma sonda fluorescente da actividade da gp-P. A preparação das amostras consistiu apenas na desproteinização do plasma com acetonitrilo. A cada alíquota (200 μL) de plasma, foi adicionado um volume igual de acetonitrilo. A mistura foi agitada no vortex (10 s) e centrifugada a 17000 rpm durante 20 min (4º C). De seguida, 200 μL de sobrenadante foram transferidos para os poços de uma microplaca de 96 poços. As concentrações de rodamina 123 foram determinadas por fluorimetria, utilizando comprimentos de onda de excitação/emissão de 480/575 nm, respectivamente. As curvas de calibração obtidas para a intensidade de fluorescência versus concentração de rodamina 123 mostraram linearidade (r2 ≥0.998) de 0,04-4 μg/mL. O limite de quantificação (LOQ) do método foi de 0,04 μg/mL. O método demonstrou ser preciso e exacto. A imprecisão global não excedeu 15% (ou 20% no LOQ) e a inexactidão variou dentro de ±15% (ou ±20% no LOQ). A rodamina 123 foi extraída a partir das amostras de plasma com uma recuperação média global de aproximadamente 90%. O método foi aplicado à determinação da rodamina 123 em amostras reais de plasma de ratos pré-tratados ou não com verapamil, aos quais foi administrada uma dose única de rodamina 123 (500 μg/kg, i.v.). Este método parece ser uma ferramenta útil para seguir a farmacocinética da rodamina 123 em plasma de rato, podendo apoiar programas de screening para a descoberta de inibidores da gp-P candidatos a fármacos.
Multidrug resistance (MDR) is a major obstacle in cancer treatment. One of the most important mechanisms implicated in MDR is believed to be the over-expression of the ATP-dependent drug efflux transmembrane transporter, P-glycoprotein (P-gp), in cancer cells. P-gp plays a significant role in the absorption and disposition of many drugs, including anticancer agents. In particular, the over-expression of P-gp in cancer cells confers resistance by preventing the sufficient intracellular drug accumulation. The aim of this study was to develop and validate a rapid and sensitive fluorimetry-based assay in rat plasma to support the in vivo identification of P-gp inhibitors, using rhodamine 123 as a fluorescent probe of the P-gp activity. Sample preparation consisted of a single-step precipitation of rat plasma proteins with acetonitrile. Each aliquot (200 μL) of plasma was added with an equal volume of acetonitrile. The mixture was vortex-mixed for 10 s and centrifuged at 17000 rpm for 20 min (4 ºC). Then, 200 μL of the supernatant were transferred to the wells of a 96-well microplate. Rhodamine 123 concentrations were measured by fluorimetric detection using the excitation/emission wavelengths of 480/575 nm, respectively. The calibration curves prepared by plotting fluorescence intensity versus rhodamine 123 concentrations were linear (r2 ≥0.998) in the range of 0.04-4 μg/mL. The limit of quantification (LOQ) of the assay was established at 0.04 μg/mL. The assay was found to be precise and accurate. The overall imprecision did not exceed 15% (or 20% in the LOQ) and the inaccuracy was within ±15% (or ±20% in the LOQ). Rhodamine 123 was extracted from rat plasma samples with an overall mean recovery of approximately 90%. The assay was successful applied to the determination of rhodamine 123 in real plasma samples collected from rats, pré-treated or not with verapamil, which received a single-dose of rhodamine 123 (500 μg/kg, i.v.). This assay seems to be a useful tool to follow the pharmacokinetics of rhodamine 123 in rat plasma, may support screening programs for discovery of drug candidates as P-gp inhibitors.