Author(s):
Santos, Michael David Lameiras
Date: 2008
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.6/4716
Origin: uBibliorum
Subject(s): Artéria umbilical; Músculo vascular liso; Cromatografia de interacção hidrofóbica; Canais de cálcio tipo L; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Outras Ciências Médicas
Description
O ião cálcio é um ião fundamental em todos os sistemas biológicos. Devido à sua capacidade para se ligar a diferentes ligandos, este ião tem um papel fundamental em muitas funções biológicas, tais como: regulação da pressão sanguínea, actividade cardíaca, proliferação celular, adesão celular, expressão génica, libertação de hormonas e de neurotransmissores. Os canais de cálcio dependentes de voltagem envolvidos no transporte deste ião para o interior da célula tornaram-se alvo de fármacos para a terapia de várias doenças, entre elas, cardiovasculares e gastrointestinais. Os canais de cálcio dependentes de voltagem tipo L são complexos polipeptídicos oligoméricos (~ 430 kDa), compostos por 4 ou 5 subunidades polipeptídicas com diferentes pesos moleculares: a subunidade α1 (190 – 250 kDa) é responsável pela formação do poro e confere as propriedades funcionais aos canais de cálcio tipo L; as subunidades auxiliares α2 (143 kDa), β (54 kDa), γ (30 kDa), δ (25 kDa), que modulam propriedades dos complexos do canal. O objectivo do presente estudo foi purificar os canais de cálcio tipo L existentes nas membranas das células do músculo liso isoladas de artérias umbilicais humanas. Para isso, foram removidos a geleia de Wharton e o sangue que rodeava as artérias. Posteriormente, isolaram-se as camadas de músculo liso a partir das artérias umbilicais. O passo seguinte constitui numa lise celular por métodos mecânicos/térmicos e em algumas centrifugações para obter as membranas celulares. Os canais de cálcio foram solubilizadas com N-Dodecil β–D–maltoside e posteriormente realizou-se uma ultracentrifugação a 210000g durante 2h00 para obter as proteínas membranares. A purificação dos canais de cálcio tipo L foi efectuada por cromatografia de interacção hidrofóbica usando a matriz epoxy sepharose. Inicialmente realizaram-se estudos em mini colunas com misturas de sais de diferentes concentrações. As diferentes fracções obtidas pela cromatografia de interacção hidrofóbica foram analisadas por electroforese SDS-PAGE e Western-Blot.
Calcium is a fundamental ion in all biological systems. Due to its capacity to bind different ligands it plays a fundamental role in many cellular functions, such as: blood clotting, cardiac activity, cell death, cell membrane maintenance, cell proliferation, cellular adhesion, gene expression, hormone release, neurotransmitters release. Voltage-dependent calcium channels involved in calcium transport across membrane became targets of drugs for therapy of several illnesses, among them cardiovascular and gastrointestinal disease. The L-Type calcium channel voltage gated are polypeptide complexes (~ 430 kDa), composed by four or five subunits with differents molecular weight: the subunit α1 (190-250 kDa) which forms the channel pore, confers most functional properties to the L-type calcium channel; and auxiliary subunits α2 (143 kDa), β (54 kDa), δ (25 kDa) and γ subunit (30 kDa), that are involved in the modulation of the properties of the channel complex. The aim of the present study was to purify the L-type calcium channels from smooth muscle cells membrane isolated from human umbilical cord arteries. To isolate this type calcium channels the Wharton’s jelly and the blood the surrounded the arteries of the umbilical cord was removed. Then, layers of smooth muscle cells were isolated from the arteries, Lise was done by mechanical and osmotic shock. After several centrifugations steps were done to obtain the cellular membranes. The solubilization of the membranes proteins was accomplished with N-dodecyl β-D-maltoside. Subsequently an ultracentrifugation at 210000 g during 2 hours was performed. The following step for the purification of the L-type calcium channels was hydrophobic interaction chromatography using the adsorvent, Epoxy-Sepharose. Initially, studies in mini columns were done with differents mixtures of salt with differents concentrations. The purity of the fractions obtained was determined by SDS-PAGE and Western Blot.